黨參多糖對腦缺血再灌注損傷大鼠血清S100-β及NSE水平的影響*

劉 飛 鄒贏鋅 焦 勇 唐 瑛

(海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心,上海 200433)

卒中危害公共健康,具有高死亡率和致殘率的特點(diǎn)[1]。腦缺血被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)的主要死亡原因。該病的預(yù)后高度依賴于早期醫(yī)療干預(yù)[2]。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液生物標(biāo)志物的循環(huán)水平與神經(jīng)組織損傷相關(guān),不僅可用于缺血性卒中尤其是早期階段(發(fā)病后72 h內(nèi))診斷,還可用于缺血性卒中的嚴(yán)重程度評估及監(jiān)測梗死進(jìn)展,甚至有助于早期成像結(jié)果呈陰性的有癥狀患者的診斷[3-4]。腦缺血后神經(jīng)元受損、膠質(zhì)細(xì)胞壞死及血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的損傷致使S100-β蛋白及神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)釋放進(jìn)入血液,其血清中水平的變化能夠反映腦損傷程度及疾病的預(yù)后[5]。

因此,本研究通過黨參多糖(codonopsis pilosula polysaccharide, CPPS)預(yù)處理后建立大鼠中腦閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,研究缺血再灌注損傷大鼠血清中S100-β蛋白和NSE水平的變化,探討CPPS對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物分組與給藥:SPF級 雄性 SD大鼠 130只,體質(zhì)量(280±20)g, 購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司,生產(chǎn)許可證號【SCXK(滬):2018-0016】。動物飼養(yǎng)于海軍特色醫(yī)學(xué)中心動物房,許可證號【SYXK(滬)2022-0033】。飼養(yǎng)條件:室溫12～24 ℃,采用12 h/12 h晝夜間斷照明,分籠飼養(yǎng),自由飲水。動物購進(jìn)后在本單位動物房飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組、依達(dá)拉奉組10 mg/(kg·bw)、CPPS低【1 g/(kg·bw)】、高【2 g/(kg·bw)】兩個(gè)劑量組,每組10只。術(shù)前2個(gè)CPPS組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每天灌胃1次,連續(xù)給藥14 d,給藥體積為1 mL/100 g;依達(dá)拉奉組按10 mg/(kg·bw)每日尾靜脈注射1次,連續(xù)給藥14 d;其余兩組給予等體積的雙蒸水。本實(shí)驗(yàn)分3批次完成。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過海軍特色醫(yī)學(xué)中心動物倫理委員會授權(quán)(NMC-2021041),整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間按照《實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行操作。

1.1.2藥品:黨參多糖 (CPPS),黃褐色粉末狀,純度32.8%,購自西安天一生物科技有限公司;依達(dá)拉奉注射液(規(guī)格20 mL∶30 mg,國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司)。

1.1.3試劑與儀器:MCAO栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司);神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、S100-β蛋白 ELASA檢測試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司);伊文思藍(lán)(evans blue, EB)(MP Bio medicals, LCC);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。752N型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及處理:各組大鼠末次給藥1 h后,采用改良Longa線栓法[6],腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)麻醉,取仰臥位,鈍性分離出右側(cè)頸總動脈、 頸外動脈及頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端,用動脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)、外動脈分叉處,將栓線通過頸總動脈小切口插入,打開動脈夾,插入深度約為18 mm,栓線入顱至大腦前動脈,以阻斷大腦中動脈所有血流來源,縫合傷口。2 h后輕輕取線恢復(fù)血流。假手術(shù)組進(jìn)行了相同的手術(shù),但不插入栓線。在手術(shù)過程中始終維持大鼠體溫和保持適宜環(huán)境溫度。

1.2.2神經(jīng)功能評分:參考經(jīng)典Zea Longa[6]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。按照5分制評分原則(0分:無神經(jīng)功能受損體征,活動正常;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失)對缺血再灌注24 h 后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分。得分在2～4分,說明造模成功。

1.2.3腦含水量測定:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組各10只,于再灌注24 h 后,采用1%戊巴比妥鈉【0.3 mL/(100 g·bw)】腹腔麻醉安樂后取腦,在冰盒上迅速分離右側(cè)腦組織并稱重(濕重)。再將右側(cè)腦組織在干燥箱110 ℃烘干24 h至恒重(干重)。按下式公式計(jì)算:

腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%

1.2.4血腦屏障通透性的檢測:采用伊文思藍(lán)染料(EB)法測定BBB的通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組各10只大鼠,于再灌注23 h 后經(jīng)尾靜脈注射2% 伊文思藍(lán)【4 mL/(kg·bw)】,注射2 h后,采用1% 戊巴比妥鈉麻醉后,打開大鼠胸腔,從左心室插入注射針頭,于右心耳部剪一小口,向內(nèi)注入0.9% 氯化鈉溶液,直至右心耳流出液體變清亮,表明已將殘存于血管內(nèi)生物EB充分排出,然后開顱取腦,沿正中線稱取腦損傷部位約100 mg腦組織,將其浸泡在3 mL甲酰胺中, 50 ℃ 水浴72 h,1 500 r/min離心10 min,取上清液。用分光光度計(jì)(λ=630 nm),測定上清液A值,計(jì)算每克腦組織中EB的含量(μg/g腦組織)。

1.2.5血清中NSE及S100-β 蛋白含量檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將大鼠麻醉后腹主動脈取血,離心取上清,-80 ℃下凍存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明書,采用ELASA法檢測血清中NSE及S100-β 蛋白。

1.2.6HE染色:給藥及建模同上,每組5只大鼠。再灌注24 h后,將麻醉后大鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行心腦灌注,然后取腦組織,將腦組織放入10%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋切片。將組織切片脫蠟,蘇木精染色,伊紅復(fù)染,水洗,脫水,透明,封片。光鏡下觀察拍照。

1.2.7尼氏小體染色:將組織切片用甲酚紫溶液56 ℃ 染色60 min,蒸餾水洗滌2次,95%乙醇分化2次,每次2 min;切片在100% 乙醇中脫水5 min,在二甲苯中清除5 min。封片,在光鏡下觀察Nissal染色的細(xì)胞。正常神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)含豐富的細(xì)胞質(zhì)和大的細(xì)胞體,伴有大量尼氏小體。而細(xì)胞受損時(shí)胞體萎縮,細(xì)胞核濃縮,尼氏小體減少或缺失。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CPPS對MCAO誘導(dǎo)的缺血大鼠的影響

大鼠建立腦MCAO模型后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失,評分為0分。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分增加(3.20±0.79,P<0.01),提示嚴(yán)重功能障礙(表1)。與模型組相比,依達(dá)拉奉組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(2.20±0.79,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CPPS高劑量組明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.20±0.79,P<0.05 ),CPPS低劑量組神經(jīng)功能評分也降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.50±0.85)。

表1 大鼠神經(jīng)功能評分Table 1 Neurological function scores of rats

同樣,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦含水量增加(79.17%±0.35%,P<0.01)。與模型組相比,依達(dá)拉奉組大鼠腦含水量明顯降低(76.95%±0.67%,P<0.01)。CPPS高劑量組腦含水量明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(77.22%±0.51%,P<0.01),CPPS低劑量組腦組織含水量降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(79.07%±0.67%)(圖1)。

注:與假手術(shù)組比較,#P<0.01;與模型組比較,*P<0.01。Note:Compared with the namely sham operation group,#P<0.01;Compared with the model group,*P<0.01.圖1 大鼠腦含水量Fig.1 The water content in rat brain

2.2 CPPS對缺血再灌注大鼠BBB通透性的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織EB含量增加(302.85±35.77,P<0.01)。與模型組相比,依達(dá)拉奉組大鼠腦組織EB含量明顯降低(249.93±60.28,P<0.05)。CPPS高劑量組腦組織EB含量明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(233.58±39.50,P<0.01),CPPS低劑量組腦組織EB含量降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(267.97±48.35)(圖2)。

注:與假手術(shù)組比較,#P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。Note:Compared with the namely sham operation group,#P<0.01;Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.圖2 大鼠腦組織EB含量檢測Fig.2 The determination of EB content in rat brain tissue

2.3 CPPS對MCAO大鼠神經(jīng)元損傷的影響

采用HE染色對MCAO誘導(dǎo)的缺血大鼠缺血側(cè)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織病理學(xué)分析。如圖3所示,假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,排列規(guī)則緊密,胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核清晰。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織疏松、細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)元出現(xiàn)壞死、核固縮。依達(dá)拉奉組及2個(gè)CPPS組均有明顯改善。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.依達(dá)拉奉組;D.CPPS低劑量組;E.CPPS高劑量組。Note:A. Sham operation group;B. Model group;C. Edaravone group;D. CPPS low-dose group;E. CPPS high-dose group.圖3 大鼠缺血側(cè)神經(jīng)元HE染色結(jié)果(×200)Fig.3 The results of HE staining of neurons on the ischemic side of rats (×200)

用尼氏染色法觀察神經(jīng)元形態(tài)。結(jié)果如圖4所示,假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,胞質(zhì)中尼氏小體分布均勻,呈藍(lán)色顆粒狀;模型組腦組織水腫疏松,神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮,核固縮,尼氏體染色不清;依達(dá)拉奉組及2個(gè)CPPS組有明顯改善。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.依達(dá)拉奉組;D. CPPS低劑量組;E.CPPS高劑量組。Note:A. Sham operation group; B. Model group; C. Edaravone group; D. CPPS low-dose group ;E. CPPS high-dose group.圖4 尼氏染色法觀察神經(jīng)元形態(tài)(×200)Fig.4 Observation of neuronal morphology by Knell’s staining (×200)

2.4 CPPS對缺血再灌注大鼠血清中NSE及S100-β水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中S100-β蛋白含量增加(0.135±0.008,P<0.01)。與模型組相比,依達(dá)拉奉組大鼠血清中S100-β蛋白含量明顯降低(0.116±0.013,P<0.01)。CPPS高劑量及低劑量組血清中S100-β蛋白含量明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.116±0.010,P<0.01)(0.112±0.012,P<0.01)(圖5)。

注:與假手術(shù)組比較,#P<0.01;與模型組比較,*P<0.01。Note:Compared with the namely sham operation group,#P<0.01;Compared with the model group,*P<0.01.圖5 大鼠血清中S100-β 蛋白含量Fig.5 The content of S100-β protein in serum of rats

同樣,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中NSE含量增加(2.62±0.37,P<0.01)。與模型組相比,依達(dá)拉奉組大鼠血清中NSE含量明顯降低(2.01±0.99,P<0.01)。CPPS高劑量及低劑量組血清中NSE含量明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.03±0.22,P<0.01)(2.14±0.14,P<0.01)(圖6)。

注:與假手術(shù)組比較,# P<0.01;與模型組比較,*P<0.01。Note:Compared with the namely sham operation group,# P<0.01;Compared with the model group,*P<0.01.圖6 大鼠血清中NSE含量Fig.6 The NSE content in rats serum

3 討論

卒中是全球第二大死亡原因,而且卒中的流行率正在上升[7]。缺血性卒中是最常見的卒中形式,以大腦動脈閉塞引起的腦組織損傷為特征,具有較高的發(fā)病率、死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率[8]。

S100蛋白是一類相對分子質(zhì)量較小及具有廣泛的生物學(xué)特性的鈣結(jié)合酸性蛋白。S100-β蛋白屬于S100蛋白家族的亞型之一,主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞以及周圍神經(jīng)的雪旺細(xì)胞內(nèi),是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白[9]。在正常情況下,S100-β蛋白不能通過血腦屏障(BBB),即對自發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)活性無明顯影響。但患腦外傷、缺血缺氧性腦病及腦血管病時(shí),BBB受損,S100-β蛋白既可直接經(jīng)受損的BBB,又可以經(jīng)腦室內(nèi)的脈絡(luò)叢或蛛網(wǎng)膜下腔的蛛網(wǎng)膜顆粒進(jìn)入血液,以導(dǎo)致血清中S100-β蛋白的含量增加。有研究證實(shí),急性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者血清S100-β濃度與梗死體積之間存在顯著相關(guān)性[10]。因此,血清S100-β可作為卒中嚴(yán)重程度的有效監(jiān)測指標(biāo)[11]。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE) 是由2-磷酸甘油轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇丙酮酸的限速酶,由α、β、γ 3種亞基以二聚體形式組成5種同工酶,其中γγ型,即NSE特異性地存在于神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,腦膠質(zhì)細(xì)胞和其他神經(jīng)組織中不含這種酶,是神經(jīng)元的標(biāo)志酶[12]。烯醇化酶γ是一種主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)外胚層細(xì)胞中的酶,能將厭氧葡萄糖轉(zhuǎn)化為適于氧化的代謝物。健康人血清NSE水平低,然而,在神經(jīng)組織損傷如腦損傷或卒中后,NSE可迅速從細(xì)胞內(nèi)釋放并進(jìn)入細(xì)胞間隙,進(jìn)而釋放入腦脊液(CSF)或通過血-腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, BCB)進(jìn)入外周血,血液中的NSE水平會出現(xiàn)強(qiáng)烈的升高,從而作為腦損傷的生物標(biāo)志物[13]。因此,NSE是觀察腦內(nèi)神經(jīng)元損傷的量的指標(biāo),在原發(fā)或激發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中檢測血清NSE水平有一定的價(jià)值。

由于NSE和S100-β蛋白在腦內(nèi)的分布存在差異性,缺血再灌注損傷后大鼠除腦血管外,神經(jīng)元、髓鞘和各種膠質(zhì)細(xì)胞等都有一定程度的損害,因此,將二者的變化結(jié)合分析可以較為全面的反映I/R后腦組織的損傷情況。

對缺血性卒中具有明顯治療作用的藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),特別是從天然來源中提取的副作用小的活性成分。多糖具有安全無毒的特性受到越來越多的關(guān)注[14]。黨參多糖(CPPS)是黨參主要生物活性成分之一,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗腫瘤[15]等作用而受到廣泛關(guān)注。在前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn)CPPS預(yù)處理可減小腦梗死面積,增加抗氧化酶活性,降低氧自由基含量,減少炎性因子的分泌,并能抑制Beclin-1表達(dá),黨參多糖具有保護(hù)腦缺血和再灌注損傷[16-17]。

本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,所有I/R大鼠血清NSE和S100-β蛋白水平均有不同程度的升高,腦水腫明顯,BBB通透性增大,提示大鼠全腦缺血再灌注損傷后存在NSE和S100-β蛋白水平升高加重腦組織損傷,腦水腫明顯,腦組織通透性增加明顯;與模型組相比較,給予黨參多糖2個(gè)劑量組NSE和S100-β蛋白水平均有不同程度降低,腦水腫程度及通透性較輕,表明黨參多糖在一定程度上可以抑制NSE和S100-β蛋白的釋放,減輕腦損傷,從而起到對腦神經(jīng)保護(hù)作用。

總之,本研究發(fā)現(xiàn),黨參多糖預(yù)處理可減輕腦缺血再灌注損傷后大鼠的腦水腫。