人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮致SH-SY5Y 細(xì)胞帕金森病模型的保護(hù)作用機(jī)制

趙文學(xué)，徐 燕#，劉冬光，孟 雪*，朱建國(guó)，姚 茹，姚景春，張貴民*

1. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 新藥藥理中心，山東 臨沂 276006

2. 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性疾病，以其在老年人群中的高發(fā)性和對(duì)社會(huì)的危害性而倍受關(guān)注，主要表現(xiàn)為震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活能力[1-2]。PD 確切的致病機(jī)制尚不明確，隨著對(duì)PD 致病機(jī)制的不斷探索，線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激學(xué)說已逐漸證實(shí)在PD 的發(fā)生和發(fā)展中扮演者重要角色，抑制PD 模型中的線粒體功能損傷與氧化應(yīng)激已成為當(dāng)前抵抗PD 的重要策略[3-5]。目前臨床對(duì)于PD 的治療主要采取對(duì)癥治療，當(dāng)下復(fù)方左旋多巴（levodopa，LDOPA）為治療PD 的最佳方案，但由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給PD 的藥物治療前景蒙上了陰影[6]。因此，探尋不良反應(yīng)小的有效治療藥物已成為PD 研究的首要問題。

中藥資源豐富，從天然產(chǎn)物中篩選出療效確切、安全無毒防治PD 的藥物具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[7]。人參皂苷Re 作為“百草之王”人參PanaxginsengC. A. Mey.中重要的活性成分，屬于四環(huán)三萜類衍生物，已被證明具有突出的神經(jīng)保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，人參皂苷Re 對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）陽(yáng)離子誘導(dǎo)的人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，人參皂苷Re 也可挽救PTEN 誘導(dǎo)性激酶蛋白-1（PTEN induced putative kinase-1，Pink-1）特異性缺失導(dǎo)致的線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物IV 活力改變，人參皂苷Re 還可逆轉(zhuǎn)PD小鼠多巴胺神經(jīng)元凋亡一系列調(diào)控基因和蛋白的異常表達(dá)來實(shí)現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用，如減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），從而減少一氧化氮（nitric oxide，NO）的生成，下調(diào)PD 小鼠黑質(zhì)部促凋亡蛋白p53 的表達(dá)，抑制MPTP 誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、調(diào)節(jié)腦內(nèi)阿片肽和抗黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡等[8-11]。課題組前期已對(duì)人參皂苷Re 在PD 發(fā)生及發(fā)展過程中的作用途徑進(jìn)行了初步探索[12]，本研究旨在深入剖析人參皂苷Re 潛在的神經(jīng)保護(hù)作用途徑及作用機(jī)制，為人參類中藥防治PD 供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)自東莞賽爾生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Re（批號(hào)B21055，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自源葉生物科技（上海）有限公司；L-DOPA（批號(hào)B21710）購(gòu)自源葉生物科技（上海）有限公司；魚藤酮（批號(hào)MB5842）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC（批號(hào)556547）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)AR1199）、線粒體蛋白提取試劑盒（批號(hào)C3601）、細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒（批號(hào)P0028）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C2008S）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C1052）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0033S）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0027）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin 抗體（批號(hào)3700S）、二抗（批號(hào)14708S）、Parkin 抗體（批號(hào)4211S）、Pink-1 抗體（批號(hào)6946S）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)15071S）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)14796S）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)9662S）、cleaved Caspase3 抗體（批號(hào)9664S）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）抗體（批號(hào)4280S）、核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號(hào)12721S）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號(hào)26416S）、谷氨酸半胱氨酸連接酶亞基（glutamatecysteine ligase catalytic subunit，GCLC）抗體（批號(hào)48005S）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ，NADPH）醌氧化還原酶-1（NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1）抗體（批號(hào)3187S）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號(hào)A1933）購(gòu)自默克（中國(guó)）有限公司；Seahorse XF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試試劑盒（批號(hào)103015-100）、Seahorse XF 糖酵解速率測(cè)定試劑盒（批號(hào)103344-100）均購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司。

1.3 儀器

AMF5000 型EVOS?成像系統(tǒng)、371 型CO2培養(yǎng)箱、1410101 型Multiskan? FC 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；PL203 型天平、S210型pH 計(jì)（梅特勒托利多有限公司）；SX-700 型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）；WP-UP-YJ-40 型號(hào)超純水機(jī)（沃特浦）；1645050 型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；FL1000 型蛋白成像系統(tǒng)（上海哈靈生物技術(shù)有限公司）；Amnis FlowSight 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Merck 公司）；Seahorse XF HS Mini 能量代謝分析儀（美國(guó)Agilent 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DME/F12 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 PD 細(xì)胞模型的構(gòu)建及人參皂苷Re、L-DOPA安全濃度的摸索

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，加入預(yù)先配制好的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 μmol/L 的魚藤酮工作液處理12、24、48 h，隨后按CCK-8 試劑盒操作說明檢測(cè)各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選出魚藤酮的最適建模濃度及最佳建模時(shí)間。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，加入預(yù)先配制好的2.5、5、10、20、40、60 μmol/L 的人參皂苷Re 工作液處理24 h，隨后按CCK-8 試劑盒操作說明檢測(cè)各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選出人參皂苷Re 的安全濃度。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，加入預(yù)先配制好的2.5、5、10、20、40 μmol/L 的L-DOPA 工作液處理24 h，隨后按CCK-8 試劑盒操作說明檢測(cè)各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選出L-DOPA 的安全濃度。

2.3 人參皂苷Re、L-DOPA對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于96 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，設(shè)置對(duì)照組、模型組、L-DOPA（2.5、5、10 μmol/L）組和人參皂苷Re（2.5、5 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入0.3 μmol/L 魚藤酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h。按CCK-8試劑盒操作說明檢測(cè)各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 細(xì)胞周期的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，設(shè)置對(duì)照組、模型組、L-DOPA（10 μmol/L）組和人參皂苷Re（2.5、5 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入0.3 μmol/L 魚藤酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h。按細(xì)胞周期試劑盒操作說明加入RNase/PI 染色工作液，通過Amnis 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在G1、S、G2期的含量分布。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS 漂洗，4 ℃、1500 r/min 離心10 min，棄上清，用500 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL 的Annexin V-FITC 與5 μL 的碘化丙啶（PI）染液，混勻后避光靜置15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。

2.6 細(xì)胞能量代謝檢測(cè)

2.6.1 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHSY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于XF 細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL XF RPMI 培養(yǎng)液，棄去，反復(fù)清洗3 次后加入XF RPMI 培養(yǎng)液，使各孔終體積為180 μL，放于37 ℃無CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，隨后按細(xì)胞線粒體壓力測(cè)定試劑盒操作說明上機(jī)檢測(cè)。

2.6.2 細(xì)胞糖酵解速率測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHSY5Y 細(xì)胞以2×104/孔接種于XF 細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，棄去各孔培養(yǎng)液，每孔加入200 μL XF RPMI培養(yǎng)液，棄去，反復(fù)清洗3 次后加入XF RPMI 培養(yǎng)液，使各孔終體積為180 μL，放于37 ℃無CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，隨后按細(xì)胞糖酵解測(cè)定試劑盒操作說明上機(jī)檢測(cè)。

2.7 線粒體功能檢測(cè)

2.7.1 MMP 的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS 漂洗，4 ℃、1500 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 羅丹明123 染色工作液重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min，棄上清加入適量PBS 重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞MMP 的變化[13]。

2.7.2 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHSY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，按ROS試劑盒操作說明對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS 含量的變化。

2.7.3 細(xì)胞內(nèi)ATP 含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHSY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，棄去培養(yǎng)基，按ATP 檢測(cè)試劑盒操作說明使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP 含量的變化。

2.8 線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

2.8.1 免疫熒光檢測(cè)Parkin、Pink-1 表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組并給藥，PBS 緩慢清洗各孔細(xì)胞，加入適量4%多聚甲醛，于37 ℃固定20 min，棄去多聚甲醛并用PBS 清洗各孔細(xì)胞，加入0.5% TritonX-100 置于37 ℃孵育15 min，PBS 洗滌后加入5% BSA 封閉30 min，加入配制好的一抗，4 ℃孵育過夜，次日棄去一抗，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，PBS 清洗后加入適量DAPI 染色20 min，通過熒光顯微鏡觀察Parkin、Pink-1 陽(yáng)性表達(dá)情況。

2.8.2 Western blotting 檢測(cè)Parkin、Pink-1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cyt-C、Nrf2、HO-1、GCLC 和NQO1 蛋白表達(dá)

（1）蛋白提取：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以4×104/孔接種于6 孔板，待其融合度達(dá)到70%時(shí)，設(shè)置對(duì)照組、模型組和人參皂苷Re（2.5、5 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入0.3 μmol/L 魚藤酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌1 遍，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，4 ℃、1200 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，棄上清，PBS 洗滌2 次，按線粒體蛋白提取試劑盒說明書提取線粒體蛋白，按細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白。

（2）Western blotting 檢測(cè)：采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，PBST 洗膜后加適量ECL 熒光劑顯影，分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 魚藤酮建模濃度及建模時(shí)間的確定

如圖1 所示，與對(duì)照組比較，SH-SY5Y 細(xì)胞給予不同濃度的魚藤酮處理12、24、48 h 后，細(xì)胞存活率呈劑量和時(shí)間相關(guān)性地降低。0.3 μmol/L 魚藤酮處理24 h 后，細(xì)胞存活率為（51.67±4.22）%，處理48 h 與24 h 相比，細(xì)胞存活率無顯著性變化，因此選擇0.3 μmol/L 處理24 h 作為魚藤酮的最佳建模濃度及建模時(shí)間。

圖1 魚藤酮對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響 (±s, n = 3)Fig. 1 Effect of rotenone on survival rate of SH-SY5Y cells(±s, n = 3)

3.2 人參皂苷Re 安全濃度的確定及對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖2 所示，SH-SY5Y 細(xì)胞給予不同濃度的人參皂苷Re 處理后，當(dāng)人參皂苷Re 的濃度達(dá)到10 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性，因此選擇2.5、5 μmol/L 的人參皂苷Re進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SH-SY5Y 細(xì)胞給予不同濃度的Ldopa 處理后，當(dāng)L-DOPA 濃度達(dá)到20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性，因此選擇2.5、5、10 μmol/LL-DOPA 進(jìn)行后續(xù)考察。

圖2 人參皂苷Re 及L-DOPA 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響 (±s, n = 3)Fig. 2 Effects of ginsenoside Re and L-DOPA on survival rate of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)魚藤酮誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.01）；給予2.5、5 μmol/L 人參皂苷Re 或5、10 μmol/LL-DOPA 處理后，細(xì)胞存活率明顯上升（P＜0.05、0.01），其中5 μmol/L 人參皂苷Re 與10 μmol/LL-DOPA 作用效果相比無差異，由此可得出人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有良好的改善作用。

3.3 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞周期的影響

如表1 所示，與對(duì)照組比較，模型組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01），S 期與G2/M 期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），表明魚藤酮可誘導(dǎo)SHSY5Y 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1期阻滯作用；與模型組比較，各給藥組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05、0.01），S 期與G2/M 期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05、0.01），以5 μmol/L 人參皂苷Re 作用效果最為顯著，表明人參皂苷Re 可顯著緩解魚藤酮誘導(dǎo)SHSY5Y 細(xì)胞周期的改變。

表1 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞周期的影響 (±s, n = 3)Table 1 Effect of ginsenoside Re on cell cycle of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

表1 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞周期的影響 (±s, n = 3)Table 1 Effect of ginsenoside Re on cell cycle of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，表2 同**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group, same as table 2

組別 劑量/(μmol·L-1) 細(xì)胞周期G0/G1/% S/% G2/M/%對(duì)照 — 21.62±2.03 41.83±3.44 30.75±2.68模型 — 57.49±2.41** 10.69±2.87** 12.78±2.28**L-DOPA 10 37.28±2.15## 22.67±3.87# 20.29±1.73#人參皂苷Re 2.5 49.25±2.08# 16.83±1.59# 18.12±1.92#5 32.56±2.67## 27.70±3.12## 24.51±1.62##

3.4 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

魚藤酮可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此接下來檢測(cè)給藥前后細(xì)胞凋亡的變化，如圖3 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡率均顯著下降（P＜0.01）。

圖3 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響 (±s, n = 3)Fig. 3 Effect of ginsenoside Re on apoptosis of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

3.5 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞糖酵解功能及線粒體氧化磷酸化功能的影響

接下來對(duì)細(xì)胞糖酵解及線粒體氧化磷酸化功能進(jìn)行檢測(cè)，如圖4-A、C 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)糖酵解PER 值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)糖酵解PER 值明顯升高（P＜0.05、0.01）。如圖4-B、D 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的最大呼吸能力、備用呼吸能力及ATP 合成能力均顯著降低（P＜0.01），質(zhì)子漏顯著增加（P＜0.01），從而造成線粒體功能損傷；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞的最大呼吸能力、備用呼吸能力及ATP 合成能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），質(zhì)子漏降低（P＜0.05、0.01），其中以5 μmol/L 人參皂苷Re 作用效果最為顯著。

圖4 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞能量代謝的影響 (±s, n = 3)Fig. 4 Effect of ginsenoside Re on energy metabolism of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

3.6 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體功能紊亂的保護(hù)作用

3.6.1 人參皂苷Re 對(duì)細(xì)胞MMP 的保護(hù)作用 接下來對(duì)線粒體功能進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)，首先檢測(cè)MMP水平的變化，如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組胞內(nèi)MMP 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)MMP 明顯升高（P＜0.05、0.01），以5 μmol/L 人參皂苷Re 作用最為顯著。

圖5 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞MMP 的影響 (±s, n = 3)Fig. 5 Effect of ginsenoside Re on MMP of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

3.6.2 人參皂苷Re 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的保護(hù)作用ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與線粒體功能紊亂密切相關(guān)，并且ROS 也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因素之一。因此接下來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成量的變化，如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜0.01），胞內(nèi)ROS 生成量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05、0.01），胞內(nèi)ROS 生成量顯著降低（P＜0.05、0.01），以5 μmol/L 人參皂苷Re 作用效果最為顯著。

圖6 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的影響 (±s, n = 3;×10)Fig. 6 Effect of ginsenoside Re on intracellular ROS production of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3; × 10)

3.6.3 人參皂苷Re 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP 含量的保護(hù)作用接下來進(jìn)一步檢測(cè)線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)——胞內(nèi)ATP 含量，如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ATP 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)ATP 含量顯著升高（P＜0.05、0.01），以5 μmol/L 人參皂苷Re 作用最為顯著。

表2 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響 (±s, n = 3)Table 2 Effect of ginsenoside Re on intracellular ATP content of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

表2 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響 (±s, n = 3)Table 2 Effect of ginsenoside Re on intracellular ATP content of SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

組別 劑量/(μmol·L-1) ATP/(μmol·L-1)對(duì)照 — 9.64±0.22模型 — 2.76±0.38**L-DOPA 10 5.75±0.87#人參皂苷Re 2.5 4.94±0.93#5 7.52±0.52##

3.7 免疫熒光檢測(cè)Pakin 和Pink-1 蛋白表達(dá)

Parkin、Pink-1 的異常表達(dá)與PD 等神經(jīng)性疾病的發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)也在線粒體功能穩(wěn)態(tài)的維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用[14]，因此本研究從Parkin 與Pink-1 對(duì)線粒體功能穩(wěn)態(tài)與PD 之間的關(guān)系進(jìn)行深入探討，如圖7 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)Parkin 和Pink-1 蛋白表達(dá)減少；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)Parkin 和Pink-1 蛋白表達(dá)增強(qiáng)。

圖7 免疫熒光檢測(cè)人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Parkin 和Pink-1 表達(dá)的影響 (×10)Fig. 7 Immunofluorescence detection of effect of ginsenoside Re on expressions of Parkin and Pink-1 in SH-SY5Y cells induced by rotenone (× 10)

3.8 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞Parkin、Pink-1、凋亡及抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.8.1 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞Parkin 和Pink-1 蛋白表達(dá)的影響 如圖8 所示，與對(duì)照組比較，模型組Parkin 及Pink-1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Parkin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05、0.01），人參皂苷Re（5 μmol/L）組Pink-1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。

圖8 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞Parkin 和Pink-1 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 8 Effect of ginsenoside Re on Parkin and Pink-1 protein expressions in SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

3.8.2 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖9 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt-C 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01），胞質(zhì)中Cyt-C 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），表明魚藤酮可破壞細(xì)胞線粒體膜通透性，導(dǎo)致Cyt-C 大量釋放，造成線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 的異常表達(dá)；與模型組比較，給予人參皂苷Re 處理后，可顯著升高線粒體內(nèi)Cyt-C 蛋白表達(dá)（P＜0.05、0.01），降低胞質(zhì)中Cyt-C 蛋白表達(dá)（P＜0.05、0.01），降低Bax、cleaved Caspase-3 的表達(dá)（P＜0.05、0.01），上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Re 可通過改變線粒體膜的通透性，抑制Cyt-C 的釋放，維護(hù)線粒體功能穩(wěn)態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖9 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 9 Effect of ginsenoside Re on apoptosis related protein expressions in SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

3.8.3 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞Nrf2、HO-1、GCLC 和NQO1 蛋白表達(dá)的影響 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的保護(hù)作用與線粒體穩(wěn)態(tài)的維系密切相關(guān)，線粒體是ROS 產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，當(dāng)ROS 含量較高時(shí)會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激亦是誘導(dǎo)PD 的主要病因之一，因此，針對(duì)人參皂苷Re 的抗氧化作用進(jìn)一步研究。如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞HO-1、GCLC 及NQO1 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），Nrf2 核轉(zhuǎn)移顯著減少（P＜0.01）；給予人參皂苷Re 處理后，細(xì)胞內(nèi)HO-1、GCLC 及NQO1 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05、0.01），Nrf2 核轉(zhuǎn)移顯著增多（P＜0.05、0.01）。

圖10 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 10 Effect of ginsenoside Re on antioxidant related protein expressions in SH-SY5Y cells induced by rotenone (±s, n = 3)

4 討論

近年來，針對(duì)PD 細(xì)胞模型的研究已逐漸成為焦點(diǎn)，常用其探索發(fā)病機(jī)制、了解藥物作用靶點(diǎn)及研發(fā)新藥等，目前常用于實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞株有大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞系、SH-SY5Y 細(xì)胞系及原代中腦細(xì)胞系等。其中SH-SY5Y 細(xì)胞系具有人類成熟神經(jīng)元的形態(tài)，與原代海馬神經(jīng)元相比更容易體外培養(yǎng)，因此被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的體外模型研究[15-18]。

MPTP 可選擇性地引起黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元損傷，成為第一個(gè)被證實(shí)有中樞DA 神經(jīng)元毒性的外源性化學(xué)物質(zhì)，但MPTP 在自然界中并不存在[19-23]，魚藤酮是一種線粒體復(fù)合物抑制劑，同時(shí)作為MPTP 的結(jié)構(gòu)類似物，具有明顯的神經(jīng)毒性，也具有高度親脂性，容易越過血腦屏障，不需要任何轉(zhuǎn)運(yùn)體即可進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元[24-27]。因此本研究選用魚藤酮作為化學(xué)誘導(dǎo)劑構(gòu)建體外PD 模型，并從線粒體功能穩(wěn)態(tài)與氧化應(yīng)激等方面對(duì)機(jī)制進(jìn)行深入研究。

本研究結(jié)果顯示，SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)魚藤酮誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升，細(xì)胞糖酵解能力及線粒體氧化磷酸化能力明顯喪失，推測(cè)魚藤酮可能通過破壞線粒體膜的通透性，導(dǎo)致MMP 下降，進(jìn)而造成線粒體內(nèi)ATP 合成障礙及線粒體膜轉(zhuǎn)換孔異常打開，從而抑制細(xì)胞糖酵解能力及氧化磷酸化能力，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)Cyt-C 大量釋放到細(xì)胞質(zhì)，繼而激活Caspase-3 信號(hào)通路，啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)；給予人參皂苷Re 處理后，上述PD 樣病理癥狀均顯著改善，推測(cè)人參皂苷Re 可能通過修復(fù)線粒體膜的通透性，抑制線粒體內(nèi)Cyt-C 的釋放，繼而維護(hù)線粒體功能穩(wěn)態(tài)，激活Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch like ECH associated protein 1，Keap1）-Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路，提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化活力，抑制線粒體介導(dǎo)的Caspase-3 凋亡信號(hào)通路，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用（圖11）。

圖11 人參皂苷Re 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制Fig. 11 Neuroprotective mechanism of ginsenoside Re on SH-SY5Y cells induced by rotenone

綜上，本研究以線粒體功能穩(wěn)態(tài)與氧化應(yīng)激學(xué)說為切入點(diǎn)，利用化學(xué)誘導(dǎo)的方式建立SH-SY5Y 細(xì)胞體外PD 模型，充分模仿散發(fā)性PD 的主要病因與病機(jī)，初步闡明了人參皂苷Re 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探索散發(fā)性PD 的環(huán)境病因提供了大力支持，也為后續(xù)PD 的中藥治療提供了寶貴的科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突