銀杏二萜內酯K 對D-半乳糖誘導的小鼠原代星形膠質細胞抗衰老作用

操嬌嬌，杜雨芯，張倩霞，吳 偉，楊穎博，肖保國，肖 偉，王振中*

1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000

2. 上海中醫藥大學中藥研究所，上海 200120

3. 中藥制藥過程與智能制造技術全國重點實驗室，江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001

4. 上海復旦大學神經病學研究所，上海 200040

腦細胞主要由神經元和神經膠質細胞（小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞等）組成。星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的細胞類型，在維持中樞神經系統復雜功能和腦環境的穩態中發揮著極其重要作用[1]，包括調節突觸傳遞、維持血腦屏障、為神經元提供結構支撐、營養支持等作用[2]。細胞衰老是人體衰老的基本機制之一，是與年齡相關的神經退行性疾病的核心組成部分。衰老細胞特征包括細胞周期停滯、細胞衰老相關分泌表型、DNA 損傷、衰老相關β-半乳糖苷酶的表達、細胞周期抑制蛋白的表達等。這些表征的衰老細胞可損害腦組織的結構和功能，引發突觸損失和認知能力下降，增加衰老相關疾病的發病率，或推動年齡相關的疾病進一步惡化[3]。因此，靶向星形膠質細胞的衰老治療可能是緩解年齡相關神經退行性疾病發生和進展的一種有潛力的治療方式。

銀杏二萜內酯K（ginkgolide K，GK）是從銀杏葉中分離出來的二萜內酯類成分，GK 作為銀杏二萜內酯B（ginkgolide B，GB）的同系物，也是血小板活化因子受體（platelet-activating factor，PAF）的拮抗劑，其抗氧化應激和對急性缺血性卒中的抗血小板聚集和神經保護作用備受關注[4-7]。本研究通過D-半乳糖誘導原代星形膠質細胞衰老模擬腦內星形膠質細胞衰老，探索GK 抗衰老的作用，同時初步探索其可能的抗衰老作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級ICR 新生鼠購自上海必凱科翼生物科技有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（滬）2018-0006。動物實驗通過上海中醫藥大學動物實驗倫理審查（批準號PZSHUTCM220110002）。

1.2 藥品與試劑

GK（質量分數≥98%）由江蘇康緣藥業股份有限公司中藥制藥過程與智能制造技術全國重點實驗室制備；D-半乳糖（質量分數≥99%，批號JF68252A）購自上海泰坦科技股份有限公司；DMEM 培養基（批號MA0212）購自大連美侖生物技術有限公司；胎牛血清（批號10099-141C）購自美國Gibco 公司；PBS（批號ST447）、胰酶細胞消化液（批號C0203）、β-半乳糖苷酶染色試劑盒（批號C0602）、RIPA 裂解液（批號P00138）、PMSF（批號ST505）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號P1045）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號P0015L）、ECL化學發光液（批號P0018FS）購自中國碧云天生物技術有限公司；NC 膜（批號66485）、PVDF 膜（批號6054520）購自美國Pall 公司；p53 抗體（批號2524S）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）抗體（批號13435S）、沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）抗體（批號9475S）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號47808S）、Ki67 抗體（批號9449S）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（3670S）、β-actin 抗體（批號4970S）、HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（批號7074S）、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 抗體（批號7076P2）購自美國CST 公司；p21 抗體（批號ab109199）、p62 抗體（批號ab109012）購自英國Abcam 公司；微管相關蛋白1 輕鏈3-Ⅱ/I（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/I，LC3-Ⅱ/I）抗體（批號NB100-2220）購自美國Novus 公司；Cy3 標記的山羊抗小鼠IgG 抗體（批號A0521）購自中國碧云天生物技術有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號DY406-05）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號DY410-05）、小鼠IL-1β ELISA 試劑盒（批號DY401-05）購自美國R&D Systems 公司。

1.3 儀器

Synergy H1 型多模式微孔檢測系統（美國Bio-Tek 公司）；Universal Hood Ⅱ Chemi Doc XRS 系統、PowerPac HC 蛋白印跡轉印系統（美國Bio-Rad 公司）；DM6B 型熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 原代星形膠質細胞的提取與培養

在超凈臺無菌環境下，取出生24 h 內新生小鼠，置潔凈大皿，75%乙醇消毒后，用經高溫高壓滅菌后的手術剪，快速剪下整個頭，再剪開頭蓋骨，用鑷子小心取下2 片皮層，置于無血清的DMEM 培養基中，待10 只新生鼠全部取完，用潔凈的巴氏管吹打皮層，直至在燈光下觀察無明顯團塊或聚集，培養基呈混懸狀，300×g離心5 min，棄無血清DMEM 培養基。加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 完全培養基適量，繼續用巴氏管吹打混勻，經70 μm 細胞濾膜濾過，除去未吹散的團塊，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養基至60 mL，混勻，每只大皿加6 mL 含細胞的完全培養基。放入37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育，細胞在培養箱中孵育24～36 h 后，輕輕搖晃后將所有培養上清回收，2500 r/min 快速離心，除去沉淀，上清重新加入大皿，不足6 mL 則用新鮮完全培養液補充。每隔1 d 置換一半新鮮培養液，至第7 天，細胞鋪滿皿底，搖床置培養箱中360 r/min 搖晃3～4 h 除去小膠質細胞和其他雜細胞。加入3 mL PBS 清洗2次，胰酶消化1 min，吹下細胞后800 r/min 離心3 min，吸去上清，加入2 mL 新鮮完全培養液，細胞計數后根據所需，即可種板進行后續實驗。GFAP 免疫熒光染色顯示星形膠質細胞純度＞95%。

2.2 β-半乳糖苷酶衰老染色

將原代星形膠質細胞以1.6×105個/孔接種于6孔板，待細胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。加入GK（50 μg/mL）[8]預處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設置不含藥物的對照組。實驗結束后，除去培養基，用1 mL PBS 清洗1次，吸凈PBS。每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液室溫固定15 min，PBS 清洗3 次后，每孔加入1 mL 染色工作液，用保鮮膜封住，37 ℃孵育過夜。次日除去染色工作液，加入1 mL PBS，于顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件對藍色染色區域進行定量分析。

2.3 Western blotting 檢測p53、p21、Lamin B1、BDNF、SIRT1、p62 和LC3Ⅱ/I 蛋白表達

將原代星形膠質細胞以1.6×106個/皿接種于大皿，待細胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設置不含藥物的對照組。收集細胞，加入含蛋白酶、磷酸酶抑制劑和PMSF 的RIPA緩沖液裂解，然后用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，TBST洗滌，加入相應一抗，4 ℃搖床孵育過夜；TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗（1∶1000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 發光試劑顯影，應用ECL 化學發光成像系統拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

2.4 免疫熒光檢測Ki67 蛋白表達

24 孔板每孔放置1 片爬片，將原代星形膠質細胞以4×104個/孔接種，待細胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設置不含藥物的對照組。除去培養液，500 μL PBS 清洗1 遍，吸凈PBS，加入300 μL 4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3 遍，每次5 min；TritonX-100 通透30 min，PBS 洗滌2 遍；加入1%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌3 遍，每次5 min，加入二抗，室溫避光孵育2 h；PBS 洗滌3 遍，每次5 min，加入100 μL DAPI 染核5～10 min；PBS 洗滌1 遍，載玻片滴10 μL 封片液（PBS-甘油1∶1），取出爬片，倒扣于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件進行分析。

2.5 ELISA 檢測IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平

將原代星形膠質細胞以1.6×105個/孔接種于6孔板，待細胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設置不含藥物的對照組。收集上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 GK 抑制D-半乳糖誘導的原代星形膠質細胞衰老

如圖1 所示，與對照組比較，D-半乳糖誘導原代星形膠質細胞中β-半乳糖苷酶表達（P＜0.001），上調p53 和p21 表達（P＜0.05、0.01），抑制Lamin B1 和Ki67 表達（P＜0.01），成功構建了星形膠質細胞的衰老模型。50 μg/mL GK 干預6 d 可顯著抑制β-半乳糖苷酶陽性表達（P＜0.001），下調p53 和p21 蛋白表達（P＜0.05），上調Lamin B1 和Ki67 的表達（P＜0.01）。表明GK 具有抑制D-半乳糖誘導的原代星形膠質細胞衰老的作用。

圖1 GK 抑制D-半乳糖誘導的原代星形膠質細胞衰老Fig. 1 GK inhibits D-galactose induced senescence in primary astrocytes

3.2 GK 抑制D-半乳糖誘導的原代星形膠質細胞衰老相關分泌表型

衰老相關分泌表型是衰老細胞分泌的一系列促炎因子、趨化因子或生長因子等現象，可對細胞的微環境和鄰近細胞產生影響。如圖2 所示，在原代星形膠質細胞分泌的一系列細胞因子中，D-半乳糖誘導的衰老模型中IL-6 和IL-1β 水平無明顯增加，GK 也無明顯抑制作用；但衰老的原代星形膠質細胞中TNF-α 的分泌顯著升高（P＜0.01），而GK 干預后顯著抑制TNF-α 的分泌（P＜0.05），提示GK可抑制衰老相關分泌表型中TNF-α 的分泌。

圖2 GK 抑制D-半乳糖誘導的衰老相關分泌表型 (±s, n = 3)Fig. 2 GK inhibits D-galactose induced secretory-associated senescence phenotype (±s, n = 3)

3.3 GK 促進原代星形膠質細胞營養因子釋放

分泌神經營養因子是星形膠質細胞的功能之一，可以對神經元的生長發育和功能維持起到營養作用。如圖3 所示，與對照組比較，模型組BDNF蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），表明衰老的星形膠質細胞分泌營養因子的功能下降；與模型組比較，GK 顯著上調BDNF 蛋白表達（P＜0.05）。

3.4 GK 促進SIRT1 表達和自噬功能

SIRT1 被稱為“長壽”蛋白，也被稱為細胞年輕化標志分子，與多種生物的衰老過程密切相關，據報道SIRT1 可通過去乙酰化抑制p53 的表達[9]，從而抑制p21 的表達[10]。自噬與衰老之間存在聯系，細胞在響應衰老信號的誘導時，自噬被抑制，受損的蛋白和細胞器無法及時降解，將進一步促進衰老通路的激活，導致細胞衰老標志物的累積和生長停滯[11]。如圖4 所示，衰老的星形膠質細胞SIRT1 蛋白表達降低（P＜0.05），而GK 可以上調SIRT1 蛋白表達（P＜0.05）。同時D-半乳糖誘導的衰老星形膠質細胞LC3-Ⅱ/I 蛋白表達降低（P＜0.05），自噬底物標志p62 蛋白表達升高（P＜0.001），表明細胞此時的自噬活動減少，導致p62 標記的降解物積聚。GK 干預則增加LC3-Ⅱ/I 蛋白表達（P＜0.01），降低泛素化蛋白p62 蛋白表達（P＜0.01），增加細胞此時的自噬活動，減少p62 標記的降解物積聚。以上結果提示GK 可能通過上調SIRT1 表達，同時促進BDNF 產生和細胞自噬，多維度協同達到抗細胞衰老的效應。

圖4 GK 促進星形膠質細胞SIRT1 表達和自噬功能 (±s, n = 3)Fig. 4 GK promotes SIRT1 expression and autophagy functions in astrocytes (±s, n = 3)

4 討論

衰老細胞不同于凋亡細胞，具有廣泛的代謝活性，但無增殖能力。自首次從體外培養非永生化成纖維細胞觀察到“細胞復制性衰老”現象以來，至今對衰老大腦的廣泛研究已經確定腦細胞的衰老是神經變性和認知能力下降的關鍵因素。研究證明，細胞衰老與阿爾茨海默病、帕金森病以及多發性硬化等多種神經退行性疾病的發生和發展有關[12-13]，研究報道，在阿爾茨海默病患者的額葉皮質中，衰老標志蛋白p16ink4a陽性的星形膠質細胞顯著高于非阿爾茨海默病的同齡人[14]。另有研究報道，黃芪甲苷可通過促進有絲分裂自噬來抑制星形膠質細胞的衰老，從而改善帕金森病模型中的多巴胺能神經變性[15]，這些報道表明靶向星形膠質細胞的衰老可能是治療或改善與年齡相關的神經退行性疾病的一種潛在的治療方式。

β-半乳糖苷酶來源于GLB1基因編碼的β-D-半乳糖苷酶，隨著細胞的衰老，增殖能力下降，其數量和大小不斷累積，其活性與衰老程度高度相關，在具有分化能力的細胞中無法檢測到，因此β-半乳糖苷酶一直是體內外鑒定衰老細胞最廣泛使用的生物標志物[16]。p53 蛋白是一種轉錄因子，在細胞應激反應中起著關鍵作用，在DNA 損傷時激活導致細胞生長停滯，指導細胞和機體的衰老。p21 是p53的下游基因，其表達受p53 調控，p21 可抑制細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的活性，具有和細胞周期蛋白N端和C端結合位點以及增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的C端結合位點，可與CDK 復合物結合并抑制其活性，進而阻滯細胞周期[17]。Lamin B1 是一種核中間絲蛋白，在DNA 復制、有絲分裂紡錘體的形成、基因轉錄和細胞增殖的維持中起著至關重要的作用。Lamin B1 的下調是衰老后的關鍵介質，是局部染色質變化的觸發因素，從而影響整體的基因表達[18]。D-半乳糖廣泛用于體內外建立衰老模型，在本研究中，使用D-半乳糖誘導原代星形膠質細胞衰老，150 mmol/LD-半乳糖處理6 d 可成功構建細胞衰老模型，表現為β-半乳糖苷酶染色和衰老標志物p53、p21 蛋白表達增加，Lamin B1 蛋白表達下降，這些結果表明該條件可以成功誘導星形膠質細胞的衰老模型。GK 的干預可以抑制β-半乳糖苷酶染色和衰老標志物p53、p21 蛋白表達增加，促進Lamin B1 蛋白表達增加。Ki67 染色在臨床上被廣泛用作增殖指標，其在細胞分裂S 期、G2期和M 期積累，G1期和G0期即降解，因此Ki67 是細胞周期進行和靜止期的分級標志物[19]。本研究結果顯示，對照組和GK 組Ki67 表達顯著多于模型組，表明正在進行分裂增殖的細胞明顯多于模型組，GK 可促進細胞增殖。這些研究數據表明GK 可以在體外抑制由D-半乳糖誘導的原代星形膠質細胞的衰老，促進細胞增殖。

衰老相關分泌表型是衰老的細胞分泌細胞因子、趨化因子、細胞外基質蛋白酶等信號分子的總稱。衰老的細胞分泌這些因子會改變局部組織微環境導致長期慢性炎癥。這些因子不僅以自分泌的方式促進細胞自身的衰老，還以旁分泌的方式影響周圍細胞的衰老[20]。衰老相關分泌表型可導致衰老相關炎癥、代謝失調、慢性疾病、老年綜合征和恢復力喪失等，減少衰老相關分泌表型的相關分泌也是臨床的一種干預方式[21]。本研究發現，衰老的星形膠質細胞會增加TNF-α 的分泌，而GK 可以減少TNF-α 的分泌。其他細胞因子IL-6 和IL-1β 可能受限于體外培養，細胞含量少，細胞因子水平處于試劑盒檢測下限，所以GK 也沒能顯示明顯抑制作用。

BDNF 可以促進神經保護和神經再生，對神經元的營養支持作用是星形膠質細胞的功能之一。衰老的星膠分泌營養因子功能下降，而GK 可以促進BDNF 的分泌，恢復其部分功能。在帕金森病患者和動物模型中也發現其黑質紋狀體通路中BDNF 水平下降，因此BDNF 可能可以作為一種治療分子。但相關研究卻表明外源性BDNF 直接送入大腦并不能緩解癥狀，且神經營養因子血腦通透性差、半衰期短、生物利用度差[22]，或許促進腦內星形膠質細胞分泌營養因子是一種更加行之有效的方法。

SIRT1 是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，主要位于細胞核內，可以去乙酰化某些關鍵蛋白，從而調控衰老信號通路。據報道，SIRT1 可以去乙酰化非組蛋白底物p53，改變其轉錄活性，從而參與細胞衰老和生物體壽命的調節[23]。SIRT1 也被稱為長壽調節因子，增加SIRT1 的表達可以延長多種生物的壽命，包括酵母、蒼蠅、蠕蟲和哺乳動物等[24]，而SIRT1 在體內的蛋白和轉錄水平會隨著年齡的增加而下降[25]，同樣，過表達小鼠大腦中SIRT1 水平可以顯著延長小鼠的壽命[26]。進一步研究表明SIRT1 具有抗衰老的作用，可以促進機體或細胞年輕化，近年來，靶向SIRT1 來預防和治療衰老相關疾病已經引起人們的注意。本研究發現GK 可以顯著激活SIRT1 的表達，表明GK 的抗衰老作用可能與SIRT1 有關。

自噬是一種分解細胞內成分的過程，可降解和回收細胞中一些受損或不需要的成分，以維持能量穩態和保護細胞免受應激，自噬在發育和疾病的過程中起著至關重要的作用。近年來研究表明自噬激活與延長壽命之間存在正相關，在調節衰老中發揮著重要作用。衛星細胞隨著年齡的增長，自噬現象消失，導致受損蛋白和細胞器累積，繼而引發衰老和干細胞耗竭[27-28]。本研究發現衰老的星形膠質細胞LC3-Ⅱ/I 的表達減少，p62 表達增加。而GK 干預則可促進LC3-Ⅱ/I 的表達上升，p62 表達減少，LC3II 是自噬形成的前體物質，在衰老的星形膠質細胞中自噬被抑制，從而導致自噬底物標志物p62不能及時被降解而增多，而GK 可以促進星形膠質細胞的自噬現象，提示GK 可能通過促進自噬來抑制星形膠質細胞的衰老，但分子機制仍有待進一步深入研究加以闡明。另有相關研究報道，在衰老的細胞中，自噬系統被激活[29]，與本研究結果相反，這可能與細胞種類不同或不同的衰老模型有關。

綜上，本研究發現GK 具有顯著的抗衰老作用，能夠促進星形膠質細胞的增殖和營養因子分泌，減少炎癥因子TNF-α 的分泌，同時促進自噬和SIRT1表達。大量研究顯示細胞的衰老是一個非常復雜的過程，是由諸多因素動態平衡紊亂導致的結局。GK介導的星形膠質細胞抗衰老作用可能通過上調SIRT1 表達，同時促進BDNF 產生和細胞自噬，多維度協同達到抗細胞衰老的效應。至于SIRT1 上調、BDNF 產生和細胞自噬相互間的關系，以及在GK抗衰老作用中的權重值得進一步利用現代細胞-分子生物學技術進行探索和驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突