天然血管基質/聚己內酯復合血管支架的制備與性能表征

陳國寶,董剛立,楊 歡,陳忠敏,王富平

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院, 重慶 400054)

0 引言

血管疾病是當前威脅人類健康的主要疾病之一[1]。2018年,我國城鄉居民因患心血管疾病而造成的死亡居城鄉居民總死亡原因的首位。當發生動脈粥樣硬化或血管閉塞時可導致組織缺血,因此需要進行血管置換。目前,常見的血管移植物大致可分為自體血管移植、異種血管移植和血管組織工程。自體移植物是臨床手術中的黃金標準,但由于反復手術、來源匱乏,不利于患者的后續治療;異種血管移植生物相容性不佳,不僅存在免疫原性,容易與機體產生排斥反應從而對機體造成損傷,還可能傳播疾病造成感染[2],很難滿足血管移植的要求。組織工程技術的快速發展為血管疾病的治療提供了一種新的解決方案,理想的組織工程血管具有一定的降解性,在植入后由宿主細胞重塑,支架的降解速率與組織生長速率相匹配,并具有和天然血管類似的結構和功能。

目前,國內外開發的血管支架主要有金屬支架[3-5]、合成高分子支架[6-7]、天然高分子支架[8-10],每類支架材料都有其優缺點,需要多種材料復合實現優勢互補。例如,金屬類血管支架仍無法有效地控制其在機體內降解的時間,且與機體之間的生物相容性較差,容易增加血栓和內膜增生風險,因此不能大量投入到臨床應用[11]。可降解聚合物支架材料與金屬類血管支架材料相比,其結構可以根據特定的孔隙率和微觀結構而精確制備,進而得到較為理想的支架材料。聚己內酯(polycaprolactone,PCL)具有廣泛粘彈性,可以模仿天然組織,但降解速率低于其他材料,且制備得到的支架硬度大,無法較好地滿足天然血管的條件。可見,單獨用聚合物制備得到的血管支架整體性能不佳,且降解速率不同,進而影響其機械性能[12]。

絲素蛋白、膠原蛋白等天然材料常用于構建血管支架。絲素蛋白具有良好的生物相容性,其化學性能和機械性能也較為穩定,因此在血管支架的制備方面應用非常廣泛[13-14]。另外,脫細胞血管也是一種有潛力的支架材料。脫細胞血管去除了細胞成分,保留組織或器官的三維結構和一些天然纖維成分,同時具有生物活性,并保留了許多細胞生長因子。盡管脫細胞血管基質在力學性能、組織相容性等方面表現出色,脫細胞血管基質復合支架體外表征良好,但目前還沒有成功的人造小口徑血管支架移植試驗案例[15]。目前,發展功能性和植入式脫細胞血管移植物面臨的挑戰主要有同種異體細胞的免疫排斥反應、自體細胞衰老、再細胞化方法的高成本等[16],同時傳統的脫細胞支架可能由于密集的細胞外基質網絡而具有較低的細胞通透性。最近,有研究表明脫細胞血管基質凝膠(decellularized vascular matrix gel,DVMG)是一種有前景的材料,不僅具有脫細胞血管基質的優點,還可以通過改變水凝膠的濃度或交聯密度來控制血管支架的機械性能。此外,DVMG具有適合細胞生長的三維結構,具有可修飾性和可加工性。但單獨DVMG力學性能較弱,常需要與高分子材料復合以進一步調整其力學性能與天然血管相匹配。

考慮到PCL力學性能好、降解無毒,而DVMG保留了許多細胞生長因子,生物相容性好,故采用PCL與DVMG復合作為血管修復支架材料,將復合材料澆筑在管狀模具上,室溫冷卻干燥后得到血管支架。制備出一系列不同比例的血管支架,并評估這些支架的微觀形貌及結構、力學性能、降解性能;得到與天然血管性能類似的血管支架,從而為心血管疾病的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新鮮豬的主動脈、甲醇(成都市科龍化工試劑廠)、無水乙醇(重慶川東化工(集團)有限公司)、冰醋酸(上海麥克林生化科技有限公司)、脫氧核糖核酸酶I (北京Solarbio生物科技有限公司)、胃蛋白酶(北京Solarbio生物科技有限公司)、聚乙二醇辛基苯基醚(北京Solarbio生物科技有限公司)、多聚甲醛(北京Labgic科技有限公司)、二甲苯(成都市科隆化學品有限公司)、中性樹膠(中國上海懿洋儀器有限公司)、伊紅蘇木素染色液(碧云天生物技術有限公司)、基因組DNA小量抽提試劑盒(碧云天生物技術有限公司)、PCL (上海麥克林生化科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(Biosharp)、磁力攪拌儀79-1 (常州國華電器有限公司)、電子天平AR1530 (梅特勒-托利多儀器有限公司)、電熱鼓風干燥箱101型(北京中興偉業有限公司)、氣浴恒溫振蕩器THZ-82A (金壇市科析儀器有限公司)、數顯恒溫水浴鍋HH-2型(常州國華電器有限公司)、真空干燥箱DZF (常州衡正電子儀器有限公司(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、切片機KD3368AM (浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、粘附載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)、力傳感器CLY30 (長春機械研究院)、傅里葉變換紅外光譜儀(珀金埃爾默股份有限公司)、TGL-16M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 DVMG的制備

DVMG制備方法如圖1所示。將豬的新鮮血管取出,經過化學和物理的方法脫細胞后得到脫細胞血管,再將其研磨成粉并用胃蛋白酶酶解得到脫細胞血管基質凝膠。屠宰場取得新鮮的豬主動脈后,將其裁剪成小塊,加入適量去離子水后,將各離心管放在氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h。向清洗后的豬主動脈中加入濃度為3 %的Triton X-100溶液,于氣浴恒溫振蕩器中振蕩浸浴12 h。再用甲醇浸沒豬的主動脈,置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩浸浴24 h進行脫脂處理,處理期間需更換甲醇3次。用配置好的DNase I稀釋液浸沒豬的主動脈,在氣浴恒溫振蕩器中于37 ℃環境下溫育豬主動脈4 h后加入適量無水乙醇振蕩4 h。用適量去離子水于37 ℃環境下振蕩浸浴豬的主動脈2 h,清除殘余的酒精。將清洗后的脫細胞豬主動脈置于37 ℃的真空干燥箱內干燥3～4 d研磨成粉保存備用。取200 mg的DVM粉,向其中加入20 mL濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶(pepsin)溶液,在37 ℃環境條件下進行攪拌,使DVM粉末酶解成為DVMG保存備用。

圖1 DVMG制備方法示意圖

1.3 復合血管支架的制備

在60 ℃條件下,用冰醋酸配置60%的PCL溶液。將配置的PCL溶液與DVMG按照DVMG∶PCL為0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1的比例在55 ℃的水浴鍋中進行混合,靜置消泡。待混合液氣泡完全散去后,用自制模具在60 ℃的水浴鍋中對不同比例的DVM-PCL混合溶液進行重復包裹,室溫冷卻脫模,保存備用。

1.4 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)觀察

將DVMG∶PCL (1∶1)、DVMG∶PCL (1.5∶1)、DVMG∶PCL (5∶1)的血管支架進行噴金處理,在真空條件下使用SEM對血管支架的表面、截面進行SEM不同倍數觀察。進行相關分析,觀察血管支架是否由于DVMG含量的改變導致支架結構的變化。

1.5 傅里葉紅外光譜檢測

將Thermo傅立葉紅外光譜儀分析儀初始化。在軟件中設置測試參數和掃描頻率,掃描背景后,向樣品倉內放入樣品開始掃描圖譜。選擇純PCL、DVMG∶PCL (1∶1)、DVMG∶PCL (1.5∶1)、DVMG∶PCL (5∶1)的血管支架作為本次紅外光譜分析所需要的材料。

1.6 力學性能測試

準備DVMG∶PCL為0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1的血管支架材料,每組各取3個。打開電腦與機器相聯通,在軟件中設置待測的形狀、測試方式等。將各比例支架均勻裁剪成條狀,用刻度尺、螺旋測微儀測量樣品的寬度、厚度、長度、標距。一切準備就緒后鼠標點擊開始運行測試,支架以5 mm/min拉伸至斷裂。支架拉斷時結束實驗,保存數據并進行處理。

1.7 支架降解能力測定

取相同質量不同配比的DVMG-PCL血管支架(0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1),每組取3個支架樣品。每組支架的質量記為M0。取12個離心管,加入適宜的PBS緩沖液,將稱重后的各比例的血管支架材料分別置于其中。氣浴恒溫振蕩器中的溫度設定為37 ℃,將離心管放入其中振蕩浸浴1周,1周后取出支架材料樣品,用濾紙吸取支架表面附著的水分,置于37 ℃的烘箱中干燥30 min,再稱重,質量記為M1。每隔1周對各組樣品進行稱重,質量記為Mn(n=1,2,3,4,n為檢測時的周數)。各比例血管支架的部分剩余率為Mn/Mn-1。

利用Origin軟件畫出血管支架的部分剩余率變化曲線,橫坐標為降解時間,縱坐標為降解每周后的剩余率(部分剩余率)。各比例血管支架的總剩余率為Mn/M0。

1.8 H&E染色

新鮮豬主動脈與經脫細胞處理后的豬的主動脈各取3組,用4%多聚甲醛固定24 h,然后用PBS溶液充分清洗固定后的組織,以除去殘留的固定液。利用不同濃度的酒精對固定新鮮豬主動脈和脫細胞豬主動脈組織分別進行脫水處理,每次處理時間為1 h。脫水過程中,需用100%酒精對組織脫水2次。放入二甲苯溶液中進行2次透明處理,每次20 min。將石蠟于60～70 ℃下熔化,將透明后的新鮮豬主動脈以及脫細胞豬主動脈組織塊置于60 ℃的真空干燥箱中2 h進行透蠟處理,冷卻過夜。包埋組織的石蠟塊經修剪后進行切片處理。收片后將載玻片在60 ℃真空干燥箱內烘烤4 h,烘烤方法為先平放烤制2 h,再豎放烤制2 h。將各組載玻片用二甲苯再次進行透明、水化處理,清洗后用蘇木精染色液與伊紅染色液對各組載玻片染色。將染色后的組織再次進行脫水處理,用二甲苯溶液進行透明處理,處理后用中性樹脂封片。將封片后的組織靜置一段時間后置于顯微鏡下觀察染色結果。

1.9 DNA含量檢測

分別取15 mg新鮮豬主動脈和脫細胞后的豬主動脈,將其處理成極細小碎塊后,按照基因組DNA小量抽提試劑盒中的步驟提取各組豬的主動脈中的DNA,在1.5 mL的離心管中取適量純化后的含DNA液體于DNA含量檢測儀上進行測定。各組豬主動脈每組測量3～5次,觀察分析DNA測量結果,判斷豬主動脈細胞是否脫除干凈。

2 實驗結果

為進一步探究支架的具體性能,對新鮮和脫細胞的豬主動脈進行H&E染色DNA含量檢測,并對各組支架進行形貌及結構觀察、傅里葉紅外光譜分析、力學性能測試、降解能力測定等理化性質方面的測定。

2.1 H&E染色結果及DNA含量檢測結果

圖2(a)是新鮮豬主動脈經H&E染色后的顯微鏡觀察效果圖。圖2(b)為經脫細胞處理后的豬主動脈經H&E染色顯微鏡觀察效果圖。2幅圖的背景色均為粉紅色,主要是因細胞質被伊紅染液染色而成,可知經脫細胞處理后的豬主動脈保留了一定的細胞外基質。觀察到左圖中存在大量的藍黑色顆粒,分布較為密集,而右圖無明顯的藍色顆粒分布。藍黑色顆粒存在的原因是新鮮豬主動脈含有較多的細胞核,從而被蘇木精染色液染成藍色。對比可知,對新鮮豬主動脈的脫細胞處理效果較好,細胞脫除較為徹底,無明顯的細胞殘余。

圖2 H&E染色結果與DNA含量檢測結果

利用基因組DNA小量抽提試劑盒提取新鮮豬主動脈和脫細胞后的豬主動脈的DNA,并用DNA檢測儀測定。每種測3次以減少測量誤差。新鮮豬主動脈組織中DNA含量為164.47±6.47 ng/mg,脫細胞后的血管組織中DNA含量為 34.67±2.16 ng/mg,達到脫細胞的標準,即脫細胞組織殘留DNA含量不超過50 ng/mg。如圖2(c)所示,新鮮豬主動脈經過脫細胞后,DNA減少明顯,新鮮豬主動脈組織與脫細胞后的豬主動脈組織中的DNA含量有顯著的統計學差異。由此可知,對新鮮豬主動脈脫細胞處理較為徹底。圖2(c)中,“****”表示統計顯著差異(P≤0.000 1)。

2.2 支架的微觀形貌及結構觀察結果

將各組從模具中脫出,進行大體觀察。如圖3所示,支架為白色管狀,內徑孔清晰貫通,顯示內徑3 mm、外徑5 mm左右,大體外觀形狀與人體血管相同。

圖3 支架形貌及尺寸

為觀察支架材料的微觀結構,對支架材料進行SEM分析。圖4(a)所示為各組血管支架分別放大3 000倍、500倍的表面SEM結果。圖4(b)所示為各組血管支架放大500倍的截面SEM結果。

圖4 不同比例DVMG-PCL支架的SEM圖

由于各組支架材料采用反復包裹成型,相較于靜電紡絲技術得到的血管支架而言受自然因素影響較大,故導致各組材料表面不均勻。反觀各組截面的SEM圖,較表面而言較為均勻。各組樣品的表面SEM圖顯示表面結構無明顯孔隙,截面SEM顯示表面結構有明顯孔隙,以便于細胞附著。出現此現象的可能原因是由于樣品在室溫下固化時混合溶液中的冰醋酸揮發所致,導致表面PCL占比較高,孔隙不明顯。但PCL具有良好的可降解性能,同時截面SEM圖出現的孔隙表明,血管支架置于體內表征時隨著支架的降解將會出現孔隙。由于各組支架孔隙較少,采用反復包裹定型的方法制備血管支架存在不足。

2.3 傅里葉紅外光譜分析結果

圖5為DVM、PCL、不同比例DVMG-PCL支架的紅外光譜分析圖。分別對各組DVMG比例的血管支架進行光譜分析,除DVM外,各組DVMG與PCL混合支架中的光譜形態大致相同。其中,PCL的特征光譜占主導地位。

圖5 DVM、不同比例DVMG/PCL支架 紅外光譜分析圖

由圖5中的DVM的紅外光譜圖可知,DVM的吸收特征峰分別為3 286、1 633、1 532、1 240 cm-1;在3 200～3 300 cm-1處有1個羥基伸縮振動峰,峰寬而鈍;在1 630～1 640 cm-1、1 530～1 540 cm-1、1 240 cm-1處出現的吸收峰分別是由酰胺I、酰胺II、酰胺III的振動引起的。各DVMG-PCL血管支架在1 150～1 170 cm-1范圍內有1個特征吸收峰,由C-N拉伸振動引起;在1 720～1 730 cm-1范圍內的譜帶區域產生尖峰,這是由于羰基伸縮振動引起;飽和烴的C-H伸縮振動峰出現在2 950 cm-1附近。

2.4 支架的力學性能結果

圖6(a)所示為DVMG與PCL進行不同比例混合得到的血管支架材料的應力應變曲線。由該曲線斜率可初步判斷4組支架的拉伸模量大小,DVMG∶PCL為0∶1 (即純PCL組)時,其斜率最大,1.5∶1組支架和1∶1組支架的應力應變曲線的斜率相近,5∶1組支架的應力應變曲線斜率最小。

圖6(b)所示為DVMG和PCL進行不同比例混合得到的血管支架材料的拉伸模量圖。由該柱狀圖可知,PCL支架、DVMG∶PCL分別為1∶1,1.5∶1,5∶1的材料支架的拉伸模量值依次為49.00±9.52 MPa,46.29±3.08 MPa,38.77±2.07 MPa和31.18±2.80 MPa。其中,PCL支架的組內誤差最大,DVMG∶PCL為1.5∶1組與5∶1組的組內誤差相近。DVMG∶PCL為0∶1組與1∶1組、0∶1組與1.5∶1組之間的顯著性差異P值分別為0.607 167 563、0.080 538,故DVMG∶PCL為0∶1與1∶1、1.5∶1組差異性不顯著。DVMG∶PCL為0∶1組與5∶1組、1∶1組與1.5∶1組、1∶1組與5∶1組、1.5∶1組與5∶1組之間的顯著性差異P值分別為0.011 478、0.006 746、0.000 347、0.004 764,均表示這幾組不同DVMG∶PCL比例血管支架材料之間的差異性顯著。圖6(b)中,ns表示差異不顯著(P>0.05),*表示差異顯著(P≤0.05),**表示差異極顯著(P≤0.01),***表示差異極其顯著(P≤0.001)。

圖6可知,DVMG的含量大小對血管支架的力學性能有一定的影響。用PCL參與制備的血管支架拉伸模量單位達到了兆帕,總體較硬,加入DVMG的意義在于改善純PCL支架的硬度,使其富有較好的彈性,能更好地達到天然血管的標準。同純PCL支架相比,DVMG∶PCL為1∶1、1.5∶1、5∶1組支架的拉伸模量值均變小,故這3組支架材料受力時,形變相對于純PCL支架較大,硬度降低,力學性能得到了改善。但DVMG含量的增加對PCL參與形成的血管支架的硬度改善有一定限制,DVMG∶PCL為5∶1組的支架材料相較于1.5∶1組的變化不大。在添加了DVMG的3組血管支架中,DVMG∶PCL為5∶1組血管支架材料的拉伸模量最小,在受力時產生的拉伸形變較大,使該支架的硬度比起純PCL支架要低,故此比例的血管支架力學性能較佳。

圖6 不同比例DVMG/PCL支架的力學性能

2.5 支架的降解能力測定結果

如圖7所示,分別將相同質量、不同比例的DVMG/PCL血管支架置于PBS緩沖溶液中,于37 ℃環境條件下在恒溫氣浴振蕩器中進行為期1個月的降解速率測定,推測其在生物體內的生物降解性能。圖7(a)和圖7(b)分別表示不同比例DVMG/PCL支架的部分剩余率和支架總剩余率。

由圖7(a)可知,材料支架每周同上一周的比值存在變化,數值均在88%以上,可知材料每周均發生降解。其中,DVMG∶PCL為5∶1的支架材料在進行第1次為期1周的降解后質量下降幅度較大。由圖7(b)可知,隨著降解時間的延長,材料支架的總剩余率均在減小,且DVMG∶PCL為5∶1組支架的總剩余率最小,可知該比例的DVMG/PCL血管支架降解最快,相對質量變化較大;DVMG∶PCL為0∶1組支架的總剩余率最大,可知該比例的DVMG/PCL血管支架降解較慢,相對質量變化小。

圖7 不同比例DVMG/PCL支架的降解性能

對4組支架材料進行比較,發現添加的DVMG含量的改變會對血管支架降解性產生影響。純PCL支架降解速率極慢,證實該支架不利于體內植入;DVMG∶PCL為1∶1組支架和 DVMG∶PCL為1.5∶1組支架的降解速率差距不大,但相較于純PCL組而言,降解速率下降明顯;DVMG∶PCL為 5∶1組的血管支架在1個月的降解時間內降解速率幅度下降最大。可見,DVMG在混合支架中的比例會對制備得到的DVMG-PCL支架降解速率產生重要影響,可為體內植入研究提供參考。

3 結束語

本研究驗證了DVMG與PCL復合制備脫細胞血管支架的可行性,2種材料的復合可使血管支架具有合適的力學性能和降解速率。通過改變DVMG的含量,驗證了DVMG含量與DVMG/PCL血管支架材料的力學性能、降解性能等因素之間的關系,即DVMG含量越高,相較于純PCL支架,支架的剛度降低,降解速率變快,更加利于血管的再生。

細胞外基質(extracellular matrix,ECM)為細胞提供了空間結構和大量的細胞外信號分子。ECM和細胞之間的相互作用錯綜復雜,能夠調節組織穩態和組織再生中涉及的各種過程,如細胞生長、遷移、分化和新ECM產生。對于脫細胞血管,主要是由ECM組成,包含膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分。這些成分對細胞粘附、遷移、增殖和分化至關重要,使血管具有承受血壓變化的機械性能[16]。植入體內后,這些天然基質能誘導組織重塑和再生。除了脫細胞血管,其他脫細胞組織也具有制造血管支架的潛力。已有研究使用脫細胞人絨毛膜構建了一種血管移植物,這種血管移植物與內皮細胞相容并具有血液相容性和抗菌性質,其力學性能和自體小直徑血管置換的黃金標準大隱靜脈相似[17]。此外,小腸粘膜下層是食品和藥物管理局批準用于制造再生生物材料的常見脫細胞基質生物材料。脫細胞支架由于密集的膠原纖維網絡而具有較低的細胞通透性,而脫細胞基質凝膠則改善了這一缺限。水凝膠具有高含水量,因此常作為細胞遞送和包封的載體[18]。脫細胞基質凝膠不僅具有天然ECM的生物化學線索、特異性結構及微環境,還表現出高度可調的機械性能、生物活性和生物降解性。脫細胞基質凝膠中的特定成分可以通過促進M1型巨噬細胞向M2型轉化來減少炎癥、加速組織修復[19]。然而,單純的脫細胞基質凝膠力學性能較弱,常與其他高分子材料復合以進一步增強其性能。例如,本研究通過將絲素蛋白與DVMG復合改善支架的整體力學性能,降低降解速率,在保留天然組織的生化特性的同時具有快速血管化的能力。文獻[20]中,隨著DVMG含量的增加,支架的剛度變低,降解速率加快,與本研究得到的結論類似。

PCL是FDA批準的高分子材料,在組織工程血管領域應用廣泛。有研究人員將PCL/聚二惡烷酮共同靜電紡絲制備了小直徑混合血管移植物,其中,PCL納米纖維的緩慢降解保持了管狀結構的完整性,而具有快速降解速率的聚二惡烷酮纖維允許細胞浸潤和ECM沉積[20]。純PCL血管支架不易降解,且力學性能與天然血管不匹配,由于生物相容性低,可能會導致出現其他并發癥。例如,與平滑肌再生不匹配的降解率導致PCL構成的電紡血管移植物增生和鈣化[21]。

脫細胞基質凝膠還具有可修飾性和可加工性[22]。脫細胞基質凝膠可以負載細胞、治療藥物或其他生物活性分子,常通過靜電紡絲或3D打印制備出符合要求的血管支架。靜電紡絲技術可以模擬ECM的納米纖維結構,有利于細胞的粘附和增殖。有研究通過靜電紡絲將PCL與大鼠主動脈基質復合,然后加載肝素和血管內皮生長因子來制造血管移植物。該移植物表現出良好的血液相容性和生物相容性,肝素的加入使得血管內皮生長因子能更可控地釋放[23]。3D打印技術可以重現血管的分層復雜結構,精確控制3D結構中細胞的位置。有研究開發了一種DVMG和明膠、藻酸鹽、細胞組合的新型生物油墨,該生物油墨能夠完整再現符合天然組織形狀和功能的血管支架,血管支架具有一定的機械性能和良好的生物相容性[24]。本研究制備的支架雖然結構簡單,但與上述方法相比制作更加便捷,成本更低。下一步研究將關注支架材料對細胞的影響,考慮植入動物體內觀察生物相容性和促進血管再生的能力。