應用微生物制劑LC對甘蔗糖廠濾泥發酵及堆肥效果研究

沈大春，孫東磊，敖俊華，陳立君，楊欣妍，盧穎林

(廣東省科學院南繁種業研究所，廣東廣州 510316)

0 引言

我國是食糖消費大國，其中食糖80%以上來源于甘蔗原料。廣泛的甘蔗種植為保障我國食糖資源自給自足奠定有力原料基礎。但糖料蔗在生產加工壓榨制糖過程中會產生大量廢棄物，如大量蔗渣、濾泥和糖蜜及其發酵酒精殘液等[1]，如果直接燃燒則會造成大量的資源浪費，而隨地棄置又會導致環境污染，特別是甘蔗糖廠濾泥的處理問題，目前大部分是直接還田做肥料或作魚塘飼料，濾泥直接還田容易引發水體和地下水污染二次污染問題，作魚塘飼料消化能力有限，同時也容易引起水體富營養化導致水環境污染[2]。

研究表明，甘蔗糖廠濾泥富含豐富的營養物質，含有大量的有機質和部分可溶性碳水化合物(如蔗糖)，同時含有氮磷鉀等大量元素，以及鈣鎂硫硅等中微量元素，養分全面豐富；濾泥既可以作為有機-無機肥料填充劑也可以作為有機堆肥的主要原料[3]，對生產有機-無機肥料過程的粘結度和水分等有較好的調節作用，同時以濾泥作為有機堆肥的主要原料，添加一定比例的碳源包括：蔗渣、糖蜜發酵廢液、中藥渣和氨基酸有機廢料等，利用濾泥高溫發酵菌劑的高效腐解作用可以實現堆肥過程中濾泥的高效降解和有機質轉化，有利于濾泥堆肥腐熟度提高和物料安全穩定[4]。

但是在濾泥堆肥過程中，大量的水分和膠結物等導致濾泥成團，溶解氧不足，微生物難以進入分解[5-8]，以及濾泥堆肥過程溫度的升高導致很多具有發酵降解功能的菌株失去活性——是限制濾泥高溫堆肥腐熟穩定的主要因素。在濾泥高溫堆肥中接種芽孢桿菌菌株可以加快堆肥過程物質轉化，縮短堆肥腐熟的周期[9-10]。高溫堆肥過程中起主要作用的是一類耐高溫細菌(如芽孢桿菌類菌株)還有少部分真菌和放線菌等[11-12]，若能將濾泥高溫堆肥過程中的優勢細菌分離進一步和有機載體復配形成高效菌劑，并將其再用于濾泥高溫有機堆肥的生產，可能會具有良好的應用前景和市場價值[13-15]。目前已有的有關濾泥肥料化利用的文獻主要集中在利用其作為輔料，同時微生物菌株主要是屬于外源添加而不屬于原位分離來源[16-18]。

本文通過原位篩選分離菌株GBIF-3制備微生物制劑LC，通過添加微生物制劑LC對比研究濾泥固體發酵及堆肥過程指標變化及過程影響，為微生物制劑LC在甘蔗糖業濾泥肥料化利用方面的推廣應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地衣芽孢桿菌菌株GBIF-3(通過采集甘蔗糖廠長期堆放濾泥的環境土壤樣本，以濾泥為唯一營養源連續富集一周分離得到該優勢菌株，進一步通過劃線分離得到單一菌株)，2018年11月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓)，菌種保藏號為GDMCC NO.60481。其生物學特性為：在LB平板上，24 h后長出菌落，革蘭氏陽性G+，菌落生長快，菌落表面相對光滑，單個菌株呈桿狀，大小1～2 μm；生理生化試驗結果顯示菌株淀粉水解、果膠分解、乙酰甲基甲醇試驗、檸檬酸鹽、氨硝、產硫化氫、吲哚試驗都呈陽性“+”；而甲基紅試驗、石蕊牛乳試驗和苯丙氨酸脫氫酶試驗呈陰性“-”。

試驗地點：選取在廣東省韶關市翁源縣茂源糖業有限公司內(110.09°E，21.32°N)。供試濾泥為糖廠副產物，水分含量72.10%，pH 6.15，干物質中有機質590.65 g/kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物制劑LC的制備

將地衣芽孢桿菌菌株GBIF-3接種到LB培養基上，溫度50℃，轉速170 r/min，振蕩培養1～2天，離心后去掉上清液取沉淀，再用100 mL的0.9%滅菌生理鹽水重懸，得到細菌菌液，調節細菌菌液的細菌OD值為0.5；將細菌菌液按重量份85%，和重量份甘蔗渣5%、重量份蔗渣生物炭5%以及重量份甘蔗糖蜜5%混合可得到微生物制劑LC。

LB培養基為：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.2.2 微生物制劑LC的酶活力測定

按照重量比5%接種至裝有100g濾泥固體發酵培養基的250 mL三角瓶中，50℃條件下培養箱固體發酵0～30天過程中每天取樣(破壞性取樣)，發酵液8000 r/min、4℃離心5 min；過濾除去菌體和固體雜質后得到粗酶液，測定木質纖維素酶活和蛋白酶活。酶活力測定方法：取0.5 mL稀釋后的粗酶液至試管中，加1 mL 1%的CMC-Na溶液和0.5 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/mL，pH值6.0)混勻，于50℃水浴反應30 min，取出，加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min中止反應，冷卻至室溫，以100℃煮沸10 min失活的粗酶液作為空白對照組，采用3，5-二硝基水楊酸比色法在540 nm下測定還原糖的量，計算酶活。

酶活力定義：酶活力的定義參照國際標準，即在相應的條件下(50℃)1 min內催化底物水解生成1μmol還原糖的酶量定義為一個酶活力國際單位(IU)，簡稱U。

濾泥固體發酵培養基為：100 g濾泥(以干重計)和50 mL無機鹽培養基；所述的無機鹽培養基配制方法為：尿素0.3 g、(NH4)2SO41.4 g、KH2PO40.5 g、CaCl2·2H2O 0.4 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、蛋白胨1.0 g、FeSO4·7H2O 5.0 mg、MnSO4·H2O 1.6 mg、ZnSO4·7H2O 1.4 mg、CoCl2·6H2O 2.0 mg，pH自然，去離子水1000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 微生物制劑LC對濾泥固體發酵降解試驗

取若干個250 mL的三角瓶，向250 mL三角瓶中加入100 g干濾泥(烘干粉狀)和50 mL無機鹽培養基，121℃滅菌后，按重量比接種(渦旋儀混勻后，用特制的5 mL滅菌槍頭直接吸取已配制好的LC制劑)5%微生物制劑LC，分別置于30℃和50℃培養箱內，紗布封口，發酵30天，實驗設置重復3次。以接種等量無菌水作為空白對照。

固體發酵結束后，去除固體發酵物料表面的菌體，于105℃烘干至恒重稱重，測定降解率，降解率=(降解前總質量-降解后總質量)/100 g×100%。

1.2.4 微生物制劑LC對甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過程效果試驗

微生物制劑LC按重量5%比例添加至1000 kg的濾泥堆肥中，周期45天，1000 kg的濾泥堆肥輔料為10 kg尿素、5 kg氨基酸廢料、100 kg蔗渣、5 kg玉米秸稈生物炭和50 kg糖蜜及發酵酒精殘液，對照為不添加微生物制劑LC，其他保持一致。在整個堆肥過程中每10天翻堆一次，每天從堆體中部隨機取樣分析物料水分含量和監測堆體上中下最高溫度并取平均值。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007進行數據統計和處理，再進一步用SPSS統計軟件進行單因素多重比較處理間的差異顯著性分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 微生物制劑LC的酶活力測定分析

由圖1、2可知，在常溫30℃和高溫50℃條件下添加微生物制劑LC固體發酵30天過程中，濾泥固體發酵物料木質纖維素酶活和蛋白酶活表現出較大差異，常溫30℃條件下，固體發酵物料木質纖維素酶活最高值為30 U/mL，蛋白酶活最高值為9.5 U/mL；而在高溫50℃條件下，固體發酵物料木質纖維素酶活最高值可達50 U/g，蛋白酶活最高值可達22 U/mL，而空白對照(不加LC，50℃)酶活基本為0 U/mL保持不變。

圖1 微生物制劑LC的木質纖維素酶活情況

總之，添加微生物制劑LC在高溫50℃條件下比在常溫30℃條件下，固體發酵的最高木質纖維素總酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。

微生物制劑LC按照重量比5%接種至裝有100 g濾泥的固體發酵培養基的三角瓶中，采用同空白對照對比的方法研究了菌劑LC在50℃，170 r/min振蕩，固體發酵15～30天的酶活變化情況，如圖1和圖2所示，在常溫30℃濾泥固體發酵條件下，微生物制劑LC產木質纖維素酶和蛋白酶總體效率不高，但在高溫50℃條件下，微生物制劑LC可以產生大量木質纖維素酶類，產酶較快且維持時間較長。說明添加微生物制劑LC對濾泥固體發酵具有明顯的促進作用，同時在不同發酵時間段不同酶活作用強度有差異，也體現了不同酶之間較好的協同作用。綜合可知：微生物制劑LC在高溫50℃條件下，以甘蔗糖廠濾泥作為營養底物，其與木質纖維素降解相關的木質纖維素總酶活表現出較高的活性，另外，其與蛋白水解相關的蛋白酶活也表現出較高的活性，總體上證明了微生物制劑LC的作用機理：在高溫條件下，微生物制劑LC產生的木質纖維素水解酶活性較高，水解作用較強，故在高溫下表現出較好的降解作用。

圖2 微生物制劑LC的蛋白酶活情況

2.2 微生物制劑LC對濾泥固體發酵降解效果分析

濾泥固體發酵降解效果如圖3和表1所示，結果表明，固體發酵30天，空白對照CK和添加微生物制劑LC在30℃和50℃條件下對濾泥固體發酵降解率分別為0.5%、8.84%和26.25%。說明在高溫條件下，微生物制劑LC產生的木質纖維素水解酶和蛋白水解酶加可以顯著加快濾泥的分解和成分的轉化，加速各降解底物的進一步分解和轉化，且在高溫條件下，微生物制劑LC對濾泥固體發酵的降解作用明顯強于常溫條件下的固體發酵作用。

表1 微生物制劑LC對濾泥固體發酵降解率

圖3 微生物制劑LC對濾泥固體發酵降解效果

2.3 微生物制劑LC對甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過程效果試驗

由圖4可知，添加微生物制劑LC對濾泥堆肥過程溫度的影響顯示，在整個堆肥過程中，添加微生物菌劑LC可以加速濾泥堆肥溫度升高，特別是在初始階段可以起到快速起爆作用，加速堆肥溫度升高，在第10天的堆體溫度可以達到73℃，通過翻堆以后在一周內又可以達到最高溫度70℃以上，直至第3次翻堆以后，整個堆肥過程由于營養物質消耗進入緩慢降溫過程，進入后熟階段；同時和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC處理基礎上對堆肥溫度提升平均10℃以上，尤其是在高溫階段，和常規堆肥溫度最高到50℃相比，添加微生物制劑LC的堆體溫度最高可以增加20℃，整體上堆肥溫度數據表明，添加微生物制劑LC可促進濾泥堆肥過程溫度的提高。

圖4 微生物制劑LC對濾泥堆肥過程溫度的影響

由圖5可知，添加微生物制劑LC對濾泥堆肥過程水分的影響顯示，在整個堆肥過程中，添加微生物菌劑LC可以促進濾泥堆肥水分的損失，特別是在翻堆及補充水分，以后隨著溫度的升高水分損失明顯加快，在前30天的堆體水分損失至堆體含水率45%，進入后熟階段堆肥含水量降至40%以下；同時和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC處理基礎上對堆肥水分損失平均促進15%以上，其中含水率=(初始含水率-現在含水率)/初始含水率×100%，尤其是在高溫階段，添加微生物制劑LC的堆體水分損失效率增加，整體上堆體水分變化數據圖4、5和堆肥溫度變化情況表明，添加微生物制劑LC可促進濾泥堆肥過程溫度的提高，同時隨著堆體溫度升高，堆體水分損失量增加。

圖5 微生物制劑LC對濾泥堆肥過程水分的影響

3 結論與展望

本文實驗得出的主要結論有：①在常溫30℃和高溫50℃條件下添加微生物制劑LC固體發酵30天，不加LC的空白對照酶活基本為0 U/mL，添加微生物制劑LC在高溫50℃條件下比在常溫30℃條件下固體發酵的最高木質纖維素總酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。②固體發酵30天，空白對照和添加微生物制劑LC在30℃和50℃條件下對濾泥固體發酵降解率分別為0.5%、8.84%和26.25%。③微生物制劑LC對甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過程效果試驗表明添加微生物菌劑LC可以加速濾泥堆肥溫度升高，最高可以達到73℃，和不添加微生物制劑LC(CK)相比，堆肥溫度提升平均10℃以上，最高可以增加20℃。

甘蔗糖廠濾泥發酵和堆肥效果數據表明，添加微生物制劑LC和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC很大程度上促進了濾泥堆肥溫度的升高和水分的損失。在高溫環境下微生物制劑LC在濾泥發酵過程表現出較高的木質纖維素酶活性和蛋白酶活性，本研究結果和相關文獻報道結果相近。溫度是反映堆肥中有機物降解和微生物活性的關鍵指標之一。高溫堆肥過程可以殺死沙門氏菌、大腸桿菌和蛔蟲卵等病原微生物，是實現堆肥無害化處理的關鍵因子[19-21]。在本次試驗中，未添加微生物制劑LC的濾泥降解率在整個發酵過程中均低于添加微生物制劑LC組，表明添加微生物制劑LC可促進濾泥的降解，這與高溫固體發酵過程中富含木質纖維素和蛋白酶類功能酶密切相關[22-24]。有關研究也表明，堆肥發酵過程中微生物分泌的胞外酶是促進堆肥無害化、減量化及資源化必不可少的活性物質，不僅能催化降解堆肥物料中各種有機質，還在腐殖質的合成以及污染物毒性的削減等過程中發揮著極其重要的作用，有效控制酶作用對實現有機廢棄物資源化利用具有重要意義[25]。

綜上所述，本文結果顯示添加微生物制劑LC促進了甘蔗糖廠濾泥的降解和堆肥過程溫度的升高，在產業化利用上將對甘蔗糖廠廢棄物合理循環利用、促進地方糖廠和種植戶增收及社會經濟穩定具有顯著的積極影響。隨著農業勞動力減少、農業化肥結構調整以及施肥方式的改變，蔗區土壤營養不平衡和酸化現象近年來呈顯著增加趨勢，如何提高蔗區的甘蔗產量和糖分一直是廣大科研人員、糖廠管理人員和蔗農關心的問題，若能進一步加大對甘蔗糖廠廢棄物的轉化利用，形成高附加值產品回到甘蔗種植管理土壤中，則可降低化學品投入的生產成本，促進綜合經濟效益提高。