力學刺激促進軟骨修復的研究進展

陳繼鑫 周沁心 余偉杰 韓金昌 劉愛峰

關節軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)組成,其功能是承受機械載荷,抵抗關節運動產生的壓應力和拉應力。由于膝關節軟骨無血管、無神經、缺乏干細胞等因素,其修復潛力有限,一旦生物力學特性受損,極易發生膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)。關節軟骨退行性病變的高發和嚴重程度,推動了以生物力學為基礎的軟骨組織工程的發展[1,2]。軟骨細胞對機械刺激的反應具有高度選擇性,例如生理負荷和頻率下的動態靜水壓和直接壓縮可刺激再生代謝,但異常的機械刺激,如靜態壓縮、拉伸和損傷性壓縮,也可導致軟骨分解和代謝變化。近年來,研究證實直接壓縮力、靜水壓力、低剪切力以及電磁力可增加ECM中聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)和Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen,COL-2)的mRNA表達,促進軟骨修復。本文總結了不同力學環境對軟骨修復的作用,以及軟骨細胞將力信號轉化為細胞內化學信號的途徑。

一、直接壓縮力

在生理條件下,關節軟骨的壓縮模量在(0.4～2.0)MPa之間[3]。軟骨的動態壓縮導致基質變形、流體流動、流動電位和電流以及物理化學變化。直接壓縮力導致軟骨細胞變形,壓縮影響軟骨細胞中的細胞內Ca2+濃度。這一過程主要通過兩種方式調節:Ca2+依賴性通道的直接機械激活和膜電位的間接改變,膜電位的改變通過電壓操縱的鈣通道來維持[4,5]。直接壓縮力可增加ACAN、COL-2的mRNA表達,對軟骨細胞增殖具有促進作用。軟骨細胞的力效應取決于加載的壓力大小、程度以及作用方式等因素。直接壓縮力可通過涉及激活環磷酸腺苷(cyclic adenosine phosphate,cAMP)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)信號級聯轉導機制,從而誘導ACAN mRNA水平升高。在直接壓縮力誘導信號的轉導中,cAMP 和PI途徑存在共同的下游介質。信號轉導的一種機制可能是通過壓縮應力選擇性激活作用,致使關鍵酶和介質的下游磷酸化;另一種機制是受到短期的壓縮應力產生的信號通過cAMP和PI途徑平行轉導到細胞核,產生協同作用,激活ACAN mRNA的轉錄[6]。具體機制如圖1所示。

圖1 直接壓縮力作用軟骨細胞信號機制圖

Paggi等[7]對負載 3D軟骨細胞的瓊脂糖水凝膠上施加0.03MPa、1Hz的直接壓縮力,結果顯示暴露于壓縮后,軟骨細胞SOX9mRNA的表達水平高約3倍,并且全面增強了軟骨 ECM標志物的產生,如ACAN、COL-2和 COL-5,同時 COL-1 mRNA表達減少。整合素是跨膜蛋白,能夠激活內部細胞信號,并通過與COL-2、COL-5和纖維連接蛋白形成鍵,將軟骨細胞連接到ECM[5]。纖維連接蛋白是A5B1整合素的ECM配體,整合素可能參與從細胞外基質向關節軟骨中的軟骨細胞傳遞壓縮誘導信號,整合素與PI信號通路偶聯[8]。整合素在軟骨機械傳遞中起著重要的作用[9,10]。

Ren等[11]研究表明,在壓力范圍[(0～0.2)MPa]和頻率0.1Hz的周期性機械應力作用下,軟骨細胞增殖和基質合成顯著增加,這與并與 Src、PLCγ1、MEK1/2和 ERK1/2的磷酸化水平升高相關。并且通過使用特異性抑制劑探索Src、PLCγ1、MEK1/2和 ERK1/2之間關系的表達和性質,研究結果表明,周期性機械應力不僅導致軟骨細胞增殖,增加ACAN和COL-2基因表達,而且還通過Src-PLCγ1-MEK1/2-ERK1/2信號通路促進軟骨細胞增殖和基質合成,該信號通路將這3個重要的信號分子連接成有絲分裂級聯。Ge等[4]對于滑膜間充質干細胞-瓊脂糖構建體施加0.25Hz、1MPa的循環動態壓縮(1h/d),結果發現肥大基因表達的顯著減少,如 COL-1、COL-10、RUNX2和MMP13等,表明直接壓縮力可以抑制軟骨細胞的肥大。循環動態壓縮促進了ACAN和 COL-2的基因表達以及軟骨形成主基因 SOX9的表達水平。此外,在整個實驗期間,轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β,TGF-β3)被添加到誘導培養基中。與單獨機械壓迫刺激比較,單獨 TGF-β3導致 sGAG和膠原含量更大的積累,說明TGF-β3在維持ECM形態方面發揮積極作用[12]。

二、靜水壓力

靜水壓力能夠使膝關節軟骨表面具有極低的摩擦系數,使膝關節有限地變形,修飾細胞形態,這是關節軟骨能夠承受高強度關節載荷的重要原因[13,14]。許多體外研究已經證實了靜水壓對軟骨組織外植體、分離的軟骨細胞、工程軟骨組織的影響。力學實驗證明,日常活動下,關節內軟骨細胞承受的靜水壓力水平為(0.1～20.0)MPa[15]。實驗研究證實,體外施加靜水壓力會影響關節軟骨基質代謝。與正常軟骨細胞比較,OA軟骨細胞中線粒體和高爾基體的數量減少,形態學表現為細胞受損的跡象,細胞中富含空泡化以及邊緣染色質的比例增加。加載靜水壓力后,OA軟骨細胞中細胞質、細胞器數量的恢復與之前的觀察結果一致,表明周期性低壓力下軟骨細胞代謝活性增加[16]。具體機制如圖2所示。

圖2 靜水壓力作用軟骨細胞信號機制圖

靜水壓力(hydrostatic pressure,HP)可通過Wnt/β-catenin途徑調節軟骨細胞代謝,增加COL-2和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達,以及軟骨形成關鍵轉錄因子Sox9的表達,但對Ⅰ型膠原的表達無影響。HP作為miRNA基因表達的調節器的重要性已被充分報道[17]。Cheleschi等[18]將軟骨細胞被暴露在循環的低HP[(1～5)MPa]和連續的靜態HP(10MPa)下3h。低周期的HP明顯減少了細胞凋亡、MMP13、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)、miR-146a和miR-181a的基因表達,觀察到COL-2和Bcl-2表達的增加。當應用10MPa的過載HP時,觀察miR-146a和miR-181a的表達增強。HP在誘導人類軟骨細胞中miRNA表達的顯著變化,表明miRNA是機械載荷調節軟骨細胞代謝的潛在媒介。許多研究證明,在OA大鼠模型的關節軟骨中Wnt/β-catenin途徑被激活,以及在體外軟骨細胞中低HP的調節β-catenin mRNA和蛋白表達[19,20]。β-catenin蛋白的表達在暴露于HP (1～5)MPa的細胞中減少。在連續的靜態HP應用后,得到了相反的結果。這是由于OA軟骨細胞被miR-34a特異性抑制劑暫時沉默時,β-catenin蛋白的表達減少;此外,miRNA的抑制限制了過載HP對β-catenin表達的負面影響,并增強了低循環壓力的影響。Savadipour等[21]使用瓊脂糖中豬軟骨細胞的3D模型在 0.5Hz、每天 5MPa的流體靜水壓力下培養,應用特定的化學抑制劑來確定瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)離子通道TRPV1、TRPV4、TRPC3和TRPC1在傳導流體靜水壓力中的作用。結果顯示,靜水壓力抑制了硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan,S-GAG)的產生。抑制TRPC3和TRPV4,則會降低S-GAG含量;然而,只有TRPV1的抑制部分減弱了靜水壓負荷誘導的S-GAG含量的減少。這表明TRPV1通道可能作為軟骨細胞中流體靜水壓力的傳感器,調節軟骨細胞合成代謝。Parkkinen等[22]還研究發現,在單層培養的牛軟骨細胞中,應用同上一研究中使用的動態靜水壓加載方案(5MPa、0.5Hz、1.5h)也會抑制S-GAG的產生,對軟骨外植體應用相同的加載卻能促進S-GAG的產生。綜上所述,靜水壓力的加載持續時間和軟骨細胞培養系統[單層(2D)或水凝膠(3D)、支架、凝膠或顆粒)以及軟骨外植體(3D)]對軟骨細胞響應靜水壓力的效應有顯著影響,改變其中任何一種條件,結果都可能完全不同。

Chen等[23]使用新型HP生物反應器,對體外軟骨模型實現了在(5～10)MPa靜水壓力下進行8周培養,通過與其他兩種類型的機械刺激(剪切應力和離心力)進行靜態培養的比較。體外三維軟骨再生的結果顯示,與其他組比較,HP組實現了最佳的軟骨形成,在細胞增殖、濕重、軟骨厚度、組織均勻性、軟骨ECM含量和機械性能等方面比較,差異均有統計學意義。HP的主要機制可能是促進細胞增殖和ECM的產生,這與既往研究報道一致,HP可以調節關鍵的信號通路,刺激生長因子的分泌,從而促進細胞增殖和ECM的產生。據推測,HP可以通過增加擴散壓力促進物質交換,從而有助于改善內部的軟骨形成,這可能是HP組的軟骨厚度明顯高于其他組的一個重要原因。第3個機制是軟骨ECM大分子的交聯增強。ECM大分子的交聯水平是決定體外循環機械性能的重要因素。根據目前的結果,HP組的主要交聯分子含量、調節交聯的關鍵酶水平和楊氏模量都明顯高于其他組,表明HP可能通過提高ECM大分子的交聯水平來改善體外循環的機械性能。這一點從膠原纖維的密度和排列上得到了進一步的支持。

軟骨細胞感知環境壓力變化的機制研究可能是未來生物力學研究軟骨修復的熱點領域。有必要評估TRPV1的機械激活與熱激活或pH激活如何誘導不同的細胞信號通路,軟骨細胞中ERK通路的負調節作用以及SOX9 mRNA的表達,進一步探討信號級聯通路是如何被靜水壓力激活,進一步研究確定刺激軟骨細胞代謝的最佳負荷條件,促進軟骨修復。

三、剪切力

低流體剪切力對軟骨具有保護作用,高剪切力可能導致炎癥、細胞死亡和軟骨降解。低剪切力可通過抑制單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/去乙酰化酶-1(sirtuin-1,SIRT1)通路,調節抵抗素誘導的人OA軟骨細胞COX-2表達。此外,低剪切力可通過ERK5誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activate receptors,PPARγ)轉錄活性,激活轉錄因子Kruppel樣因子4(kruppel-like factor 4,KLF4),降低IL-1β誘導的NF-κB的水平,達到軟骨保護的作用。具體機制如圖3所示。

圖3 剪切力作用軟骨細胞信號機制圖

Su等[24]研究發現,血清和滑液中抵抗素水平與KOA嚴重程度呈正相關,對人OA軟骨細胞施加短時間(1～2h)低剪切力(2dyn/cm2),發現剪切力通過抑制NF-κB 和環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),減弱抵抗素對 COX-2 表達的影響。然而,施加較長時間(3～4h)剪切力會增加 NF-κB 轉錄活性,從而增強了抵抗素對 COX-2 表達的影響。NF-κB 可能是低剪切力的主要下游轉錄因子,以控制抵抗素刺激的人 OA 軟骨細胞中 COX-2 的表達。此外,兩種剪切模式對抵抗素刺激的COX-2表達的調節是通過增加AMP激活的AMPK/SIRT1通路的表達來實現的。Guan等[25]將高流體剪切力(20dyn/cm2)48h持續作用于人類軟骨細胞,發現COX-2、IL-1β和成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)水平上調,MMP-1表達顯著增加。IL-1β、COX-2依賴性PGE2激活PI3K-Akt和p38信號通路,這些信號通路又通過NF-κB和c-Jun-反式激活途徑負責MMP1的合成。綜上所述,不同強度的剪切力和持續時間可能具有調節軟骨細胞信號轉導和功能的差異,從而控制軟骨代謝穩態。

既往研究發現,KLF4在胃腸道、血管、皮膚、骨骼和其他組織中高表達。KLF4可在小鼠關節軟骨細胞中表達,其活性與小鼠關節軟骨細胞外基質的成熟以及基質金屬蛋白酶和凝集酶的表達有關。Chang等[26]研究發現,在人軟骨細胞中,2dyn/cm2剪切力通過ERK5誘導PPARγ轉錄活性以增加KLF4轉錄,再由KLF4誘導減弱IL-1β刺激的NF-κB激活,從而降低了IL-1β誘導的NF-κB的水平。通過熒光素酶實驗和染色質免疫共沉淀實驗證實了PPAR γ在KLF4基因啟動子中的結合。既往研究也已經證明,PPAR γ是軟骨細胞中的軟骨保護轉錄因子,其表達和激活可以延緩OA的發展,起到軟骨保護的作用。在人類軟骨細胞中,EKR5和PPAR γ作為正機械調節因子,可響應2dyn/cm2剪切力來激活KLF4轉錄的軟骨保護作用。相反,PPAR γ也被發現在高強度剪切力刺激的軟骨細胞中發揮作用,導致軟骨細胞凋亡。KLF4的軟骨保護作用,為今后OA患者的臨床治療提供新的途徑。

四、電磁力

電磁力(pulsed electromagnetic fields,PEMF)是物理學上沃爾夫定律、膠原的壓電特性和流電位的概念,能夠促進骨和軟骨生長。PEMF已被證明可以刺激人關節軟骨細胞增殖,并增加牛關節外植體和豬軟骨細胞中軟骨ECM的生成,并減少促炎性細胞因子的釋放,抑制軟骨細胞凋亡[27]。PEMF在軟骨內成骨過程中刺激大鼠蛋白多糖(proteoglycan,PG)和COL-2 mRNA表達增加[28]。這些研究表明,PEMF可能有助于保護軟骨的完整性和功能。具體機制如圖4所示。

圖4 電磁力作用軟骨細胞信號機制圖

TGF-β在維持軟骨穩態和ECM形態方面發揮積極作用。TGF-β1刺激COL-2的合成,可抑制大鼠膝關節軟骨軟骨細胞凋亡和MMP13表達。Ye等[29]將OA模型小鼠暴露于1.6mT、頻率為75Hz,PEMF以延緩軟骨退化,保護軟骨下骨小梁微結構。PEMF促進ACAN的表達,抑制 IL-1β、ADAMTS4和MMP13的表達。此外,體外研究中,PEMF刺激了牛軟骨用高劑量的 IL-1β培養的外植體。結果表明,PEMF對軟骨細胞增殖和細胞外基質成分有積極影響,并且可用于保護軟骨免受骨關節炎期間高炎性細胞因子水平的有害影響。Stefani等[28]對犬軟骨移植模型予以1.5mT、頻率為75Hz的PEMF刺激,結果在成熟軟骨外植體中觀察到明顯的GAG和COL-2沉積,軟骨缺損部位再生。這些研究表明,PEMF可以增加關節軟骨基質合成代謝,減少炎性細胞因子表達和關節軟骨基質分解代謝,在治療軟骨退變方面有巨大的潛力。

Varani等[30]研究報道,PEMF可增強間充質干細胞的成骨和軟骨分化。PEMFs暴露通過直接激活成軟骨信號通路(即 TGF-β/SMAD)和間接旁分泌機制(由 MSC分泌蛋白介導)增強 MSC成軟骨分化。PEMFs刺激還可作為 MSCs和軟骨細胞的趨化信號,從而有利于細胞遷移至損傷部位,促進組織修復。此外,PEMFs對軟骨細胞增殖和細胞外基質成分有積極影響,發揮強大的抗炎作用,保護軟骨組織免受促炎性細胞因子分解代謝活性的影響。PEMF還可以上調X-連鎖凋亡抑制蛋白的表達,下調Bcl相關蛋白(Bcl-associated X-protein, Bax)的表達,被認為是最有效的caspase抑制劑。caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵分子,caspase抑制劑能夠有效地抑制caspase的活性,阻止細胞凋亡,這可能與抑制MAPK信號通路有關。Yang等[31]研究顯示,PEMF改善了軟骨基質軟骨細胞凋亡和自噬,PEMF通過抑制TNF-α和IL-6信號轉導,減輕OA的進展。PEMF處理后(75Hz、3.8mt、1h/d)的OA兔和大鼠關節軟骨中Bax和caspase-3的表達降低, TNF-α和IL-6信號可能是PEMF保護軟骨細胞凋亡和自噬的關鍵因素,該研究具有軟骨保護的潛在價值。

五、展 望

近年來通過生物力學刺激軟骨以及軟骨細胞的研究,調節軟骨細胞代謝,達到修復軟骨的作用,這為臨床進行骨修復與重塑提供了新的思路與方法。本文中直接壓縮力、靜水壓力、低剪切力以及電磁力,在各種體內及體外力學實驗中,可通過各種物理刺激轉化為化學刺激的信號通路與分子機制,增加COL-2和ACAN的表達,降低炎性細胞因子的表達,抑制ECM的降解,起到軟骨保護的作用。然而,不同類型機械應力、力的加載持續時間、頻率和軟骨細胞培養系統都對軟骨細胞響應力學刺激有顯著的影響,各個因素以及物理刺激轉化為化學刺激的信號通路與分子機制仍需進一步探索。

目前,研究力學載荷影響軟骨修復尚處于初步階段,許多力學響應的作用靶點、調控機制尚不明確。軟骨細胞感知環境壓力變化的機制研究可能是未來生物力學研究軟骨修復的熱點領域,有助于更好地理解軟骨細胞的力學傳導,以及機械應力在組織工程和軟骨修復中的作用。此外,了解軟骨細胞的機械轉導途徑可能有助于開發能夠刺激軟骨細胞合成代謝途徑或抑制分解代謝途徑的藥物,從而進一步研究確定刺激軟骨細胞代謝的最佳負荷條件,促進軟骨修復,為臨床治療KOA提供新思路與方法。