鎮巴臘肉生產過程中微生物組成及多樣性變化

左瑤 朱聯旭 路宏朝 任宏強 王令 王珊珊 吳國飛 張濤

摘? 要：基于高通量測序技術，對鎮巴臘肉加工過程不同階段的微生物種群組成進行鑒定和分析，同時對細菌表型及相關功能進行預測。結果表明：鎮巴臘肉生產加工過程中，真菌豐度大于細菌豐度，并隨著發酵時間及加工工藝變化，微生物群落存在明顯的演替；鎮巴臘肉中豐度最高的細菌為厚壁菌門（Firmcutes）和變形菌門（Proteobacteria），優勢細菌屬隨著加工步驟推進由原料肉樣品中的大腸-志賀氏菌屬演替為腌制時期和熏制時期的葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和乳桿菌屬（Latilactobacillus）；豐度最高的真菌門為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），優勢真菌屬由鐮刀菌屬（Fusarium）和被孢霉屬演替為鐮刀菌屬（Mortierella）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）；基于菌落演替變化及細菌表型和功能預測，發現鎮巴臘肉在加工過程中有害微生物不斷減少，利于發酵的微生物逐漸增加，促進鎮巴臘肉風味物質形成。

關鍵詞：鎮巴臘肉；微生物多樣性；高通量測序；微生物群落演替

Abstract： High-throughput sequencing technology was used to identify and analyze the microbial community in Zhenba bacon at different stages of processing， and bacterial phenotypes and related functions were predicted. The results showed that during the processing of Zhenba bacon， the abundance of fungi was greater than that of bacteria， and there was an obvious succession of microbial community during the fermentation process. The most abundant bacteria were Firmcutes and Proteobacteria. As the process proceeded， the dominant bacteria changed from Escherichia coli and Shigella in the raw meat samples to Staphylococcus， Psychrobacter and Latilactobacillus at the curing and smoking stages. The most abundant fungal phyla were Ascomycota and Basidiomycota， and the dominant fungi changed from Fusarium and Alternaria to Mortierella and Debaryomyces. Based on the microbial community succession and the prediction of bacterial phenotype and functions， it was found that during the processing of Zhenba bacon， the harmful microorganisms decreased continuously， and the microorganisms conducive to the fermentation process gradually increased， which promoted the formation of flavor substances of Zhenba bacon.

Keywords： Zhenba bacon; microbial diversity; high-throughput sequencing; microbial community succession

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018

中圖分類號：TS251.51? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：

引文格式：

左瑤， 朱聯旭， 路宏朝， 等. 鎮巴臘肉生產過程中微生物組成及多樣性變化[J]. 肉類研究， 2023， 37（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZUO Yao， ZHU Lianxu， LU Hongzhao， et al. Changes in microbial composition and diversity during the production of zhenba bacon[J]. Meat Research， 2023， 37（5）：? . （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

臘肉具有獨特的風味、色澤、口感和質地，是一種傳統腌干肉制品，品種、類型繁多[1]。臘肉屬于發酵肉制品，其原料肉在自然條件或人工設定的環境下，通過微生物或酶的發酵作用，發生一系列生物、化學及物理變化，形成具有特殊風味、色澤和質地，且能長時間保藏的肉制品[2]。臘肉在發酵過程中，微生物菌群是影響其風味、口感和營養價值的關鍵因素[3-4]。受自然環境和飲食習慣影響，不同地區臘肉具有明顯的風味差異和地域特色，這主要受臘肉生產過程中微生物種群差異的影響[5]。周瑩等[6]通過高通量測序技術解析安徽地區徽派臘肉的微生物多樣性，發現其優勢菌群為乳球菌屬、嗜冷桿菌屬和葡萄球菌屬等；文開勇等[7]研究發現，四川臘肉的優勢微生物為葡萄球菌屬和曲霉屬；李彥虎等[4]研究表明，甘肅地區隴西臘肉中環絲菌屬、肉食桿菌屬及乳桿菌屬等是其中的優勢菌屬。

陜西省鎮巴縣地屬北亞熱帶季風氣候，境內植被豐茂，自然環境優良，具有悠久的臘肉生產歷史和成熟的生產工藝[8]，鎮巴臘肉形成了自己獨特的風味和口感，2010年獲地理標志產品保護。鎮巴臘肉生產主要采用傳統加工方式，依賴自然發酵[9]。由于鎮巴臘肉生產過程中沒有發酵劑等添加，故鎮巴臘肉中的風味物質等形成主要靠發酵過程中的微生物參與原料的諸多生化反應，受微生物多樣性及種群結構影響較大。本研究應用高通量測序技術，分析鎮巴臘肉腌制和熏制過程中微生物多樣性，為優化鎮巴臘肉發酵工藝提供數據支撐，為鎮巴臘肉產品提質創新和相關產業發展提供基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

鎮巴臘肉生產主要有原料肉修整、腌制和熏制過程。其中生肉預處理主要將原料分割至相應大小肉坯，洗掉血污、肉表浮油，瀝干表面水分；然后將食用粗鹽均勻涂抹于表面，置于香樟木桶，室溫腌制8～9 d；腌制結束后轉至熏房，保持熏房溫度為25～45 ℃，熏制30～32 d。根據鎮巴臘肉生產過程，分別選擇原料肉（修整后，M）、腌制中期（腌制4 d，S4D）、腌制末期（腌制8 d，S8D）、熏制中期（熏制16 d，F16D）和熏制末期（熏制32 d，F32D）5 個時期的樣品，切取表層0.3～0.5 cm肉樣，每組樣品采集3 份平行樣品，分別標記M1～M3、S4D1～S4D3、S8D1～S8D3、F16D1～F16D3、F32D1～F32D3，置于50 mL無菌離心管中，低溫保存，快速送回實驗室后置于－80 ℃冰箱保存。

1.2? ?儀器與設備

Synergy HTX酶標儀? ?香港基因有限公司；Legend Micro 21高速離心機、5424EQ766751 24 孔離心機? ?德國Eppendorf公司；G560E振蕩器? ?美國Scientific Industries公司；9902 96 孔聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀? ?美國Thermo Fisher公司；1795微型離心機? ?天根生化科技（北京）有限公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品處理

每種樣品分別取約5 g，剪碎至1 cm左右大小，加入10 mL滅菌生理鹽水漩渦振蕩3～5 min充分懸浮，重復2 次，收集上清液。6 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體。使用基因組DNA提取試劑盒提取微生物基因組DNA，檢測DNA質量和濃度后置于－20 ℃保存備用。

1.3.2? ?DNA片段擴增及測序

將處理后的樣品送至北京擎科生物科技有限公司，完成DNA提取后，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）PCR擴增細菌16S rDNA的V3～V4區域，以及引物ITS 1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS 2-Rev（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴增真菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）區域。PCR擴增體系為10×PCR buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）35 μL、模板DNA 10 ng、正反向引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 U，加dd H2O補齊體系至50 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環25 次，最后72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。純化目標DNA后基于該公司Illumina Novaseq測序平臺完成測序。

1.4? ?數據處理

DNA樣品質檢合格后基于Illumina Novaseq 6000平臺，采用雙末端測序的方法，經堿基識別得到原始序列。隨后使用Trimmomatic v0.33和Cutadapt 1.9.1軟件對原始序列進行過濾，同時識別并去除引物序列，基于Usearch v10軟件將序列拼接起來，并根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾。使用QIIME2軟件進行去噪并去除嵌合體序列，得到最終的有效序列，同時劃分樣品的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），統計樣品的ACE、Chao 1、Simpson和Shannon指數來評估樣品α多樣性。參考Silva數據庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋，繪制樣品微生物門、屬水平分布柱狀圖。通過t檢驗和線性判別分析效應量（line discriminant analysis （LDA） effect size，LEfSe）完成樣品組間差異分析。通過BugBase和PICRUSt2軟件對樣品中微生物的表型及功能進行分析預測。

2? ?結果與分析

2.1? ?高通量測序結果質控及聚類分析

由表1可知，測序共得到845 613 條優質細菌16S rDNA V3～V4區序列和841 258 條優質真菌ITS序列，結果覆蓋率達100.00%，說明測序深度足以代表樣品中微生物的多樣性，測序結果代表樣品中微生物的真實情況。使用QIIME2軟件對所得到的序列進行去噪和聚類，15 個樣本共產生414 個細菌OTUs和1 974 個真菌OTUs，可以反映樣品中細菌的豐度。其中樣品F16D1中細菌OTUs達到155 個，樣品S8D2僅有50 個；樣品F32D3產生315 個真菌OTUs，S4D3僅產生263 個真菌OTUs，總體而言，樣品中真菌豐度大于細菌豐度。

基于OTU對臘肉生產過程5 個階段樣品的微生物群落多樣性進行聚類分析，繪制Venn圖，利用Venn圖可以清晰地展示樣品中共有和特有的特征數目，以達到評估不同樣本間OTUs組成及分布異同的目的。由圖1可知，鎮巴臘肉制作過程各時期中共有的細菌OTUs數量為9 個，真菌OTUs數量為56 個。其中樣品M、S4D、S8D、F16D、F32D獨有的細菌OTUs分別為51、19、50、35、12 個，獨有的真菌OTUs分別為320、348、303、90、94 個。樣品M共有125 個細菌OTUs和718 個真菌OTUs，樣品S4D共有98 個細菌OTUs和721 個真菌OTUs，樣品S8D共有171 個細菌OTUs和705 個真菌OTUs，樣品F16D共有199 個細菌OTUs和578 個真菌OTUs，樣品F32D共有162 個細菌OTUs和561 個真菌OTUs。結果表明，在鎮巴臘肉生產過程中F16D中細菌微生物豐度最高，S4D細菌微生物豐度最低；S4D真菌微生物豐度最高，F32D真菌微生物豐度最低。不同生產時期樣品的微生物組成有差異，細菌OTUs隨加工工藝變化和時間延長浮動較大，而真菌OTUs在加工過程中不斷降低，說明鎮巴臘肉樣品中真菌豐度受加工階段和時間影響，并逐漸下降。

2.2? ?α多樣性分析

α多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性。Chao 1指數和ACE指數是微生物群落豐度指數，反映物種數量的多少。Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，即不同物種分布越均勻，則認為群落具有越大的多樣性。Shannon指數和Simpson指數越大，說明樣品的物種多樣性越高。

由圖2A可知：臘肉樣品中S4D的細菌Shannon指數和Simpson指數均最低，F16D的Shannon指數達到最高，F32D的Simpson指數最高，說明S4D中的細菌物種多樣性最低，熏制時期2 種樣品細菌物種多樣性最高。M和S4D有顯著差異，這表明腌制處理對于樣品中的細菌組成影響較大；Chao 1和ACE指數在M和S4D中最低，F16D中最高，說明F16D中細菌物種豐富度最高。由圖2B可知：樣品中真菌的Shannon指數和Simpson指數在M、S4D和S8D均處于較高水平，在熏制處理時期有所下降，說明熏制處理對于臘肉樣品中真菌組成有影響；Chao 1和ACE指數在S8D最低，熏制時期顯著上升。綜上所述，熏制是鎮巴臘肉生產過程中重要的發酵步驟，對臘肉樣品中微生物組成有較大影響。

2.3? ?鎮巴臘肉中菌群結構分析

由圖3可知，通過對特征序列進行分類學注釋、統計并聚類分析，在臘肉樣品中共鑒定出11 個細菌門和13 個真菌門，以及部分未分類和注釋的微生物，其中細菌以變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為主要優勢菌群，真菌以子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為主要優勢組成部分，且子囊菌門在各加工時期均屬于優勢菌群，其相對豐度在整個加工過程中一直保持在50%以上，為臘肉樣品中第一優勢真菌群。M組變形菌門細菌占據絕對優勢，相對豐度達到91%，在腌制處理后相對豐度顯著降低至14%，隨腌制時間延長和熏制加工后，相對豐度回升至50%左右。臘肉樣品中厚壁菌門相對豐度也隨加工處理時間的延長和工藝變化而產生波動，加工處理最終階段穩定在50%左右。

為進一步揭示鎮巴臘肉生產過程中不同時期細菌組成變化，將先前測序所得序列處理后，基于屬分類水平將樣品中微生物進行聚類分析，由圖4可知，M組臘肉樣品中占比較大的細菌菌屬為大腸-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），其相對豐度為37%，通過加工工藝處理后其相對豐度降低至10%以下。在腌制處理時期，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、球菌屬（Macrococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）相對豐度不斷上升，球菌屬在S4D組達到最高，其相對豐度由M組的3%上升至51%；葡萄球菌屬和嗜冷桿菌屬也在S4D和S8D組相對豐度上升至30%和12%。熏制處理后，樣品中主要的細菌菌屬為弧菌屬（Vibrio）、乳桿菌屬（Latilactobacillus），其相對豐度分別為35%和19%；到熏制后期（F32D組），樣品中的葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬相對豐度回升，成為這一時期優勢菌群，其相對豐度分別為39%和23%。

真菌組成較細菌組成更復雜，種類更多。其中鐮刀菌屬（Fusarium）在各個發酵時期相對豐度均有10%左右，在F16D組相對豐度最高，達到11%。被孢霉屬（Mortierella）相對豐度在各個發酵時期均穩定在5%左右。熏制處理后，庫爾茨曼氏菌屬（Kurtzmaniella）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）相對豐度上升，F16D和F32D組分別達到11%和25%，成為熏制時期的優勢真菌。

綜上結果表明，在鎮巴臘肉發酵過程中，微生物組成在不斷發生極大變化，優勢菌群有明顯的演替現象。如大腸-志賀氏菌屬、不動桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等菌屬在未處理的原料肉樣品中為主要細菌屬，這幾類細菌廣泛分布于外界環境，如水體、土壤中[10-11]，故推斷是由于原料肉存放期間和加工過程的間隙附著在樣品表面，但在腌制和熏制時期相對豐度降低。在發酵過程中葡萄球菌屬等生肉時期的非優勢菌群成為主要組成部分，在發酵后期乳桿菌屬等成為優勢菌群，這說明不僅優勢菌群存在演替現象，非優勢菌群也存在演替現象。

2.4? ?鎮巴臘肉不同加工時期微生物組成差異分析

為明確鎮巴臘肉加工過程中不同時期的微生物屬水平組成差異，對樣本數據每2 組間進行t檢驗，由圖5可知：較生肉時期樣品，腌制處理后，葡萄球菌屬細菌相對豐度顯著上升；隨著加工進程推進，熏制完成后樣品中希瓦氏菌屬（Shenwanella）相對豐度上升，罕見小球菌屬（Subdoligranulum）相對豐度下降。腌制加工后相較生肉樣品而言真菌組成變化不大；熏制加工處理后，對比生肉樣品真菌組成差異較明顯，靈芝屬（Ganoderma）和冬蟲夏草屬（Cordyceps）等菌屬相對豐度上升，曲霉菌屬（Aspergillus）和長西氏菌屬（Naganishia）等菌屬相對豐度下降。對比S8D和F32D組真菌物種豐度差異，可以看出熏制工藝可以有效增加曲霉菌屬和長西氏菌屬的豐度。

綜上結果表明，腌制工藝可有效增加樣品中的葡萄球菌屬細菌相對豐度，熏制工藝對于臘肉樣品中真菌菌群的組成和結構影響較大，加工前后菌群結構差異顯著。

LEfSe分析用于評估每組微生物種類的重要性。由圖6可知，共分析得到36 種細菌生物標記物和42 種真菌生物標記物，其LDA值大于4.0，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。加工處理后的樣品較原料肉樣品微生物結構發生顯著變化，生肉時期的菌群多為有害菌，在腌制加工后轉變為葡萄球菌屬等細菌，熏制前期也出現了乳桿菌屬，熏制后期的樣品中葡萄球菌屬等細菌也占據主要地位。

各個發酵時期的真菌演替較明顯，菌群結構組成變化較大。在熏制后期的樣品中以酵母菌屬（Saccharomycetes）和德巴利氏酵母屬等為主要菌群，其LDA值最高，說明酵母菌屬和德巴利氏酵母屬菌種在鎮巴臘肉發酵后期至成品時期中起重要作用。

綜上結果可以看出，在鎮巴臘肉生產發酵過程中菌群演替明顯，各時期發揮重要功能的微生物組分變化較大，說明鎮巴臘肉發酵過程是多種微生物共同作用的。葡萄球菌屬、酵母菌屬和德巴利氏酵母屬等菌群LDA值較其他菌群高，表明其在鎮巴臘肉原料發酵過程中起主要作用。

2.5? ?鎮巴臘肉中微生物的功能相關性分析及預測

基于OUT水平分類，使用BugBase對組內功能途徑的生物水平覆蓋表型進行預測，由表2可知，BugBase預測結果表明，臘肉發酵各時期的微生物組成變化顯著，其表型也有較大差異。在M組樣品中，革蘭氏陰性菌占細菌中的主要地位，其相對豐度高達90.92%，厭氧型和兼性厭氧型細菌相對豐度超過50%，并且潛在致病性細菌占比也較大。腌制加工后，S4D和S8D組樣品中細菌組成主要為革蘭氏陽性菌，相對豐度均在60%以上；相對原料肉樣品，腌制后的樣品中包含質粒、轉座子等可移動基因元件的細菌相對豐度降低至20%左右，潛在致病性細菌含量也降低至10%以內，說明腌制過程可以有效降低潛在致病性細菌的含量。在加工處理末期，熏制完成后革蘭氏陽性菌和陰性菌相對豐度基本持平，厭氧型和兼性厭氧型細菌占比相對需氧細菌較高，約為60%，潛在致病性細菌在加工過程中相對豐度有所浮動，在加工末期穩定在16.88%，相較未處理（M組）有所降低，但仍然存在一定程度的風險。

為更進一步探究臘肉發酵各時期細菌的功能，使用PICRUSt2軟件，對各時期樣品KEGG生物代謝通路進行分析，以觀測不同組樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。由圖7可知，臘肉中發酵各階段的細菌功能主要是參與各類代謝途徑，相對豐度最高的代謝途徑為全局圖和概覽圖（Global and overview maps），在發酵各時期相對豐度達到40%以上；氨基酸代謝（Amino acid metabolism）和碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）途徑次之，相對豐度在各發酵時期均處于9%和6%以上；能量代謝（Energy metabolism）途徑、輔因子及維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）途徑、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）及脂代謝（Lipid metabolism）途徑相對豐度在臘肉發酵各時期均占2%～5%。除此之外，臘肉樣品中的細菌功能還集中在膜運輸（Membrane transport）、復制與修復（Replication and repair）、信號轉導（Signal transduction）、翻譯（Translation）等途徑。

3? ?討? 論

鎮巴臘肉加工工藝主要為腌制、自然發酵和熏制等環節，過程中影響因素較多，微生物結構也較為復雜。本研究選取加工過程中各時期的鎮巴臘肉材料表層組織作為研究對象，通過高通量測序技術對發酵各時期樣品進行微生物多樣性檢測與分析。從OUT層面，對比文開勇等[7]研究的四川臘肉中細菌微生物豐度高于真菌這一特性，鎮巴臘肉中細菌OTUs數量顯著低于真菌OTUs數量，發酵各時期的OTUs數量也有較顯著差異，細菌豐度顯著低于真菌豐度。腌制中期和熏制中期樣品分別為真菌豐度和細菌豐度最高，這2 個過程是加工工藝轉變的關鍵期，因此微生物群落組成受加工工藝變化影響，微生物群落組成變化較大。在發酵過程中，鎮巴臘肉的微生物組成有明顯的演替現象，先前研究[4，6]也表明，隴西臘肉和徽派臘肉均在發酵過程中有菌落演替現象，且不僅優勢菌群，非優勢菌群同樣具有演替現象，說明加工工藝對臘肉中微生物組成影響較大，是臘肉生產過程微生物群落演替的主要驅動力。

鎮巴臘肉中細菌的主要組成部分是變形菌門和厚壁菌門，這2 種細菌廣泛存在于隴西臘肉[4]、四川臘肉[7]、新疆傳統風干肉[12]及恩施臘肉[13]等我國各地腌臘肉制品中，在其他種類的發酵肉制品中，如干腌草魚[14]、即食雞肉[15]、駱駝肉香腸[16]和貴州傳統酸酢肉[17]中，變形菌門和厚壁菌門同樣是優勢菌門，這2 類細菌廣泛存在于各類發酵肉制品中，不受原料和工藝限制。另有研究[15]表明，變形菌門細菌豐度會隨低溫處理時間延長而下降，鎮巴臘肉表層組織的變形菌門豐度在低溫腌制時下降，隨后在高溫熏制過程中，其豐度又有所回升。鎮巴臘肉中的主要細菌屬為葡萄球菌，葡萄球菌是參與脂肪代謝的重要細菌[18]，主要參與不飽和脂肪酸的代謝，調控發酵過程中脂肪氧化[4]。同時具有較強的蛋白酶活性，分解蛋白質產生特定芳香類物質和多肽[19]，優化臘肉口味并抑制不良風味，不僅是諸多腌臘肉類產品加工生產發酵過程中重要的微生物發酵劑[3，12，20]，還是肉制品發酵過程中重要的風味菌[14，21-22]。

真菌部分主要的優勢菌門為子囊菌門，優勢菌屬多為酵母菌屬、鐮刀菌屬和被孢霉屬。酵母菌由于其發酵特性，廣泛存在于各種發酵產品中，是發酵肉制品中常見的菌種。酵母菌可以降解臘肉中的脂肪和蛋白質，產生醇類化合物，與乳酸菌發酵產生的酸結合產生酯類化合物，進一步豐富臘肉的風味和色澤[5]。部分酵母菌可以在高濃度鹽和高pH值環境中發酵[1]，有利于優化臘肉的發酵環境，減少雜菌干擾，降低臘肉制品的酸度。被孢霉屬真菌具有產多聚不飽和脂肪酸和轉化有機化合物的能力[23-24]，且霉菌同樣是發酵肉制品中的常見真菌，有研究表明，部分霉菌可以產生脂肪酶，可作為外源發酵劑用于發酵，改善肉制品質構，加速臘肉脂肪的分解，增加風味物質前體的積累[25-26]；抑菌隔氧，防止肉制品的腐敗[27]。需要注意的是，這類微生物并非全都無害，部分霉菌會產生具有毒性的次生代謝物，主要由曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等真菌產生[28]，鐮刀菌屬是動物飼料生產過程中最常見的污染真菌之一，并且廣泛存在于食品和飼料生產的發酵等加工過程中[29]，是生產過程中難以避免的問題之一。

鎮巴臘肉在發酵過程中微生物結構變化受工藝影響，微生物功能主要集中在代謝方面，氨基酸、碳水化合物、脂類等物質代謝是臘肉發酵過程主要的揮發性前體物質和風味物質的主要來源。并且臘肉發酵過程中厭氧型和兼性厭氧型微生物相對豐度高于需氧型微生物，這為臘肉發酵環境優化提供了良好的基礎。本研究發現未處理的原料肉表面組織存在較多的潛在致病微生物，如大腸-志賀氏菌屬，這類細菌是一種常見的食源性致病菌[30]。由于生肉未經處理，在放置和運輸過程中接觸空氣、水體等，很多環境中的細菌易附著在生肉表層，在經過清洗、腌制等處理后，潛在致病性菌種相對豐度也有所降低，同時在后續加工及包裝環節配合一定的滅菌工藝來降低鎮巴臘肉的風險性，延長鎮巴臘肉的貨架期。

4? ?結? 論

本研以鎮巴臘肉不同加工時期的材料為研究對象，通過高通量測序分析不同加工時期樣品中微生物的16S V3～V4區序列和ITS序列，共檢測到414 個細菌OTUs和1 974 個真菌OTUs。研究發現，鎮巴臘肉生產過程中微生物群落組成變化較大，優勢細菌門為變形菌門和厚壁菌門，優勢細菌屬由原料肉樣品中的大腸-志賀氏菌屬逐漸演替為腌制時期的葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬，以及熏制時期的乳桿菌屬；優勢真菌門為子囊菌門和擔子菌門，優勢真菌屬也由鐮刀菌屬和被孢霉屬演替為鐮刀菌屬和德巴利氏酵母菌屬。同時發現，鎮巴臘肉生產過程中的微生物主要為厭氧型和兼性厭氧型細菌，其功能主要集中在氨基酸、碳水化合物等能量物質代謝途徑，這些功能有助于鎮巴臘肉的風味物質形成，為解析其風味物質組成提供參考。

參考文獻：

[1] 張秋會， 王晗， 祝超智， 等. 自然發酵臘肉中酵母菌的分離鑒定及其發酵特性研究[J]. 食品與發酵工業， 2022， 48（14）： 113-117. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029561.

[2] 張根生， 潘雷， 岳曉霞， 等. 發酵肉制品加工過程中風味物質形成和影響因素研究進展[J]. 中國調味品， 2022， 47（1）： 200-205. DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2022.01.039.

[3] 吳寶森， 孫玥暉， 劉姝韻， 等. 發酵肉制品中脂肪、蛋白質水解氧化與微生物的關系[J]. 食品安全質量檢測學報， 2017， 8（3）： 832-837. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2017.03.020.

[4] 李彥虎， 贠建民， 趙風云， 等. 隴西臘肉傳統制作過程中細菌群落演替對脂肪水解及氧化的影響[J]. 食品科學， 2021， 42（10）： 154-161. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20200219-198.

[5] 葛芮瑄， 羅玉龍， 劇檸. 傳統發酵肉制品中微生物菌群對風味形成的研究進展[J]. 微生物學通報， 2022， 49（6）： 2295-2307. DOI：10.13344/j.microbiol.china.210563.

[6] 周瑩， 王兆明， 涂健， 等. 基于16S rRNA的徽派臘肉加工過程中微生物群落結構分析[J]. 肉類研究， 2021， 35（3）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201215-289.

[7] 文開勇， 汪月， 文鵬程， 等. 四川傳統臘肉中微生物群落結構研究[J]. 食品與發酵工業， 2020， 46（3）： 36-42. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.022133.

[8] XI Linjie， ZHANG Jing， WU Ruixiao， et al. Characterization of the volatile compounds of Zhenba bacon at different process stages using GC-MS and GC-IMS[J]. Foods， 2021， 10（11） 2869. DOI：10.3390/foods10112869.

[9] 朱聯旭， 李崇勇， 孟怡璠， 等. 基于氣相色譜-離子遷移譜分析鎮巴臘肉貯藏過程中揮發性風味成分變化[J]. 食品安全質量檢測學報， 2022， 13（15）： 4832-4839. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2022.15.047.

[10] 翟盼盼， 吳宇騫， 陸堅. 不動桿菌屬分類的研究進展[J]. 新發傳染病電子雜志， 2020， 5（1）： 51-55; 59. DOI：10.19871/j.cnki.xfcrbzz.2020.01.012.

[11] 王聞卿， 蘇靖華， 傅慧琴， 等. 食源性氣單胞菌屬種水平監測和表型特征研究[J]. 中國食品衛生雜志， 2014， 26（1）： 1-5. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.01.008.

[12] 王俊鋼， 李宇輝， 劉成江， 等. 新疆哈薩克族傳統風干肉中細菌多樣性分析及安全評價[J]. 中國食品學報， 2021， 21（11）： 209-218. DOI：10.16429/j.1009-7848.2021.11.023.

[13] 董蘊， 王玉榮， 王堯， 等. 基于變性梯度凝膠電泳和MiSeq高通量測序技術分析恩施地區臘肉的細菌多樣性[J]. 肉類研究， 2018， 32（10）： 37-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201810007.

[14] ZHAO Dandan， HU Jun， CHEN Wenxuan. Analysis of the relationship between microorganisms and flavour development in dry-cured grass carp by high-throughput sequencing， volatile flavour analysis and metabolomics[J]. Food Chemistry， 2022， 368： 130889. DOI：10.1016/j.foodchem.2021.130889.

[15] QIU Mengjia， XIAO Xingning， XIAO Yingping， et al. Dynamic changes of bacterial communities and microbial association networks in ready-to-eat chicken meat during storage[J]. Foods， 2022， 11（22）： 3733. DOI：10.3390/foods11223733.

[16] FONTANA C， BASSI D， LOPEZ C， et al. Microbial ecology involved in the ripening of naturally fermented llama meat sausages： a focus on lactobacilli diversity[J]. International Journal of Food Microbiology， 2016， 236： 17-25. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2016.07.002.

[17] WANG Hanyu， SU Wei， MU Yingchun， et al. Correlation between microbial diversity and volatile flavor compounds of Suan zuo rou， a fermented meat product from Guizhou， China[J]. Frontiers in Microbiology， 2021， 12： 736525. DOI：10.3389/fmicb.2021.736525.

[18] BERDAGUE J L， MONTEIL P， MONTEL M C， et al. Effects of starter cultures on the formation of flavour compounds in dry sausage[J]. Meat Science， 1993， 35（3）： 275-287. DOI：10.1016/0309-1740（93）90033-E.

[19] HU Yingying， ZHANG Lang， LIU Qian， et al. The potential correlation between bacterial diversity and the characteristic volatile flavour of traditional dry sausages from Northeast China[J]. Food Microbiology， 2020， 91： 103505. DOI：10.1016/j.fm.2020.103505.

[20] 熊力， 易浪波， 粟桂蓉， 等. 基于宏基因組學分析湘西臘肉的細菌多樣性[J]. 中國微生態學雜志， 2022， 34（1）： 23-28. DOI：10.13381/j.cnki.cjm.202201005.

[21] 趙改名， 李珊珊， 崔文明， 等. 不同來源臘肉中細菌菌群結構與風味相關性分析[J]. 食品與發酵工業， 2021， 47（13）： 246-253. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026439.

[22] LUO Yulong， ZHAO Lihua， XU Junqiang， et al. Effect of fermentation and postcooking procedure on quality parameters and volatile compounds of beef jerky[J]. Food Science and Nutrition， 2020， 8（5）： 2316-2326. DOI：10.1002/fsn3.1515.

[23] WAGNER L， STIELOW B， HOFFMANN K， et al. A comprehensive molecular phylogeny of the Mortierellales （Mortierellomycotina） based on nuclear ribosomal DNA[J]. Persoonia， 2013， 30： 77-93. DOI：10.3767/003158513X666268.

[24] ZHANG Huidan， CUI Qiu， SONG Xiaojin. Research advances on arachidonic acid production by fermentation and genetic modification of Mortierella alpina[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2021， 37（1）： 4. DOI：10.1007/s11274-020-02984-2.

[25] 于華， 黃丹， 陳卓， 等. 四川臘肉中產脂肪酶霉菌篩選及產酶條件研究[J]. 中國食品添加劑， 2016（12）： 78-83. DOI：10.3969/j.issn.1006-2513.2016.12.005.

[26] PIZZOLATO MONTANHA F， ANATER A， BURCHARD J F， et al. Mycotoxins in dry-cured meats： a review[J]. Food and chemical Toxicology， 2018， 111： 494-502. DOI：10.1016/j.fct.2017.12.008.

[27] 蔡嘉銘， 王際輝， 陶冶， 等. 霉菌發酵劑對干發酵香腸的理化指標、氧化程度及風味的影響[J]. 食品與發酵工業， 2020， 46（5）： 17-22. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.022880.

[28] HAQUE M A， WANG Yihui， SHEN Zhiqiang， et al. Mycotoxin contamination and control strategy in human， domestic animal and poultry： a review[J]. Microbial Pathogenesis， 2020， 142： 104095. DOI：10.1016/j.micpath.2020.104095.

[29] 肖柯， 張霖， 朱寒劍， 等. 乳酸菌對真菌毒素的減毒研究進展[J]. 食品科學， 2022， 43（15）： 283-293. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20210603-042.

[30] 盧鑫， 王立娟， 郭威， 等. 食品中志賀氏菌檢測技術研究進展[J]. 食品工業科技， 2022， 43（1）： 410-416. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020100045.