骨/軟骨類器官構(gòu)建策略及應(yīng)用前景

白 龍, 蘇佳燦

(上海大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200444)

伴隨我國老齡化社會的加速到來, 材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展以及人們生活水平、醫(yī)療保健、康復(fù)水平的顯著提高, 人們對人體組織器官修復(fù)和置換等方面的需求日益迫切[1]. 由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等重大疾病導(dǎo)致的各類骨/軟骨損傷修復(fù), 一直也是骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)[2]. 近年來, 骨組織工程的興起為骨/軟骨損傷的修復(fù)治療開辟了全新的研究方向.骨形成相關(guān)活性因子/細(xì)胞與生物活性材料支架載體的有機(jī)復(fù)合, 是骨組織工程構(gòu)建的起始和關(guān)鍵, 也是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3-4]. 然而, 傳統(tǒng)骨組織工程的設(shè)計(jì)原則缺乏生物材料對骨組織形成過程中不同階段、多種細(xì)胞、特異微環(huán)境等多維度、多層次的有序調(diào)控, 無法有效誘導(dǎo)空間化骨微環(huán)境特征, 成骨/軟骨效果有限, 進(jìn)而極大地限制其引導(dǎo)骨/軟骨再生的活性. 此外, 骨組織工程的研究缺乏接近人體骨組織本身特性的體外模型, 支架材料和種子細(xì)胞的篩選單一依靠體內(nèi)測試, 周期長、成本高, 無法滿足現(xiàn)實(shí)科研和臨床需求. 因此, 亟需開發(fā)能夠促進(jìn)骨/軟骨組織有序再生修復(fù)的新技術(shù).

類器官是近年來發(fā)展起來的新興生物技術(shù), 主要通過干細(xì)胞自組織方式, 在體外三維(three dimension, 3D) 培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化形成有功能的組織復(fù)合體[5-6]. 類器官具有來源組織或器官的部分關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特征. 迄今為止, 研究者已成功建立了一系列人體組織(如腦、肝、腎、腸、皮膚、骨骼、血管) 類器官模型. 類器官技術(shù)在器官發(fā)育、疾病模擬、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域顯示出廣泛應(yīng)用前景, 2017 年被Nature Methods 列為年度技術(shù)[7]. 骨髓干細(xì)胞或骨內(nèi)膜細(xì)胞通過增殖、分化得到骨類器官(如骨小梁、軟骨等類器官), 這些骨類器官表現(xiàn)出與自然骨類似的生理和結(jié)構(gòu)特征, 如呈現(xiàn)特定的生理氧和代謝梯度、維持胞外和細(xì)胞間的連接等特點(diǎn)[8-9]. 然而, 與心、腦等組織類器官相比較, 骨類器官研究尚處于起步階段. 本工作系統(tǒng)總結(jié)了骨/軟骨類器官發(fā)展歷程、構(gòu)建策略、評價(jià)表征、機(jī)制探索以及臨床應(yīng)用等方面的前沿進(jìn)展, 通過舉例分別簡述了骨和軟骨類器官的構(gòu)建過程, 最后對骨/軟骨類器官發(fā)展可能遇到的問題和方向進(jìn)行了總結(jié)和展望.

1 類器官

類器官是指人類成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞經(jīng)體外3D 培養(yǎng)后, 自誘導(dǎo)形成的帶有特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞簇. 這一類器官雖不能稱為真正意義上的人體器官, 其卻能從構(gòu)造與功能上與人體真實(shí)器官高度相似, 并可在體外持續(xù)穩(wěn)定傳代培養(yǎng). 過去10 年中, 類器官的發(fā)展被譽(yù)為干細(xì)胞研究中最令人振奮的進(jìn)展之一. 正如交通方式的更迭, 從人力時(shí)代的馬車, 到蒸汽時(shí)代和電力時(shí)代的火車, 再到目前新時(shí)代的飛機(jī)汽車, 生命科學(xué)領(lǐng)域的研究模型也在不斷更迭, 從初代的細(xì)胞培養(yǎng)、1.0 時(shí)代的動物模型、1.5 時(shí)代的器官芯片, 已然進(jìn)步到目前2.0 時(shí)代的類器官(見圖1). 器官芯片雖然在藥物篩選和安全性評估中極具發(fā)展?jié)摿? 但其存在明顯缺陷.目前器官芯片存在細(xì)胞來源少、干細(xì)胞分化不穩(wěn)定、芯片細(xì)胞種類單一、體外培養(yǎng)無法長時(shí)間培養(yǎng)等問題, 這些導(dǎo)致器官芯片的仿真程度仍然有限. 此外, 構(gòu)建芯片所需聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 材料存在疏水問題, 芯片制備方式多樣不統(tǒng)一無規(guī)范, 制造成本高無法量產(chǎn). 最近提出的類器官芯片(organoid-on-a-chip) 概念與器官芯片類似, 只是在體外培養(yǎng), 突出使用的是具有三維結(jié)構(gòu)的類器官而不是單純二維培養(yǎng)的細(xì)胞. 類器官芯片作為器官芯片的重要發(fā)展方向之一, 伴隨類器官技術(shù)的發(fā)展, 有望成為未來藥物開發(fā)、篩選和安全性評估的重要平臺.

圖1 交通方式與生命科學(xué)研究模型更迭的對比Fig.1 Comparison of transportation modes and evolution of research models

早在20 世紀(jì)80 年代, “類器官” 一詞便已提出, 但直到2009 年, 荷蘭科學(xué)家Hans 團(tuán)隊(duì)首次將腸道干細(xì)胞在體外培養(yǎng)成具有類腸的隱窩狀和絨毛狀上皮區(qū)域的3D 結(jié)構(gòu), 即小腸類器官(small-intestinal organoids), 由此開啟了類器官的研究[10]. 此后, 類器官研究步入高速發(fā)展期. 目前, 多種類器官已在體外被成功構(gòu)建, 包括大腦、腎臟、胃、小腸、卵巢、結(jié)腸、肺、膀胱、肝臟、胰腺、食道、心臟等正常組織及相應(yīng)的腫瘤組織類器官[11-12].

類器官技術(shù)作為一種全新的前沿科技, 在多個研究應(yīng)用領(lǐng)域中極具發(fā)展?jié)摿? 包括發(fā)育機(jī)理學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué), 以及研究藥品毒性與藥效等試驗(yàn)領(lǐng)域[5,13]. 類器官技術(shù)的發(fā)展為人類健康研究和新藥篩選創(chuàng)造了一個全新平臺, 這也是對目前二維細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型策略的高信息量互補(bǔ). 另外, 利用類器官技術(shù)可以獲得最貼近真實(shí)人類健康細(xì)胞, 進(jìn)行細(xì)胞靶向治療也成為可能. 同時(shí)利用類器官所培育的干細(xì)胞群可以替換損傷或疾病的正常細(xì)胞, 實(shí)現(xiàn)類器官進(jìn)行自體和同類異體組織治療, 而未來這一科技在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也將具有很大的發(fā)展?jié)摿? 日本東京醫(yī)科齒科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)從患者健康腸道中提取出了黏膜干細(xì)胞, 并將其誘導(dǎo)培養(yǎng)成腸道類器官, 2022 年該研究團(tuán)隊(duì)將體外培養(yǎng)的腸道類器官移植至患者潰瘍性大腸處, 其安全性嘗試結(jié)果將在一年后得到驗(yàn)證. 這種再生移植技術(shù)為世界首創(chuàng)的再生醫(yī)學(xué)嘗試, 若進(jìn)展順利, 潰瘍性大腸炎有望被徹底治愈, 這也為“克羅恩病” 的治療提供了可能. 雖然類器官治療技術(shù)已經(jīng)展出了治療頑疾的潛力, 但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍處于起步階段,后續(xù)仍有廣闊的發(fā)展空間. 此外, 通過這種技術(shù)手段, 結(jié)合CRISPR/Cas9 技術(shù)手段可以改善先天性遺傳異常情況, 使健康的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞重新回流入病人體內(nèi), 并通過后期的再融合重新進(jìn)入正常細(xì)胞中[14]. 在癌癥治療領(lǐng)域中, 病人來源的類器官已被預(yù)測為十分有效的藥篩手段. 在實(shí)施治療期間, 根據(jù)病人樣本來源的類器官可初步檢測病人體外對多種藥物的反應(yīng), 從而對癌癥病人的治療進(jìn)行有效引導(dǎo)和效果預(yù)判. 隨著類器官技術(shù)的發(fā)展和其衍生的生產(chǎn)技術(shù)的研發(fā),類器官將被應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域.

然而, 類器官的發(fā)展仍然面臨諸多問題和挑戰(zhàn). 類器官研究中最主要的問題是重復(fù)性和一致性, 這與過程管理欠缺和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)缺失有一定的關(guān)系. 類器官在構(gòu)建階段因機(jī)械參與程度低、人為影響較大, 導(dǎo)致系統(tǒng)偶然誤差較大. 另外, 類器官檢測方式和檢測儀器過于缺乏, 活體觀察較多使用形態(tài)學(xué)觀察, 斷點(diǎn)觀察用的較多的是熒光檢測的各項(xiàng)數(shù)據(jù), 對類器官數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)檢測的光學(xué)、電化學(xué)等技術(shù)目前仍極不成熟. 目前, 很多科研工作者專注于創(chuàng)新類器官, 制作出的類器官有腺體、脾、腎、海馬體、垂體等, 但無法做出一個符合特定指標(biāo)(如大小、形態(tài)、基因表達(dá)量等) 的類器官, 也無法滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)(如類器官間的方差等). 這些問題也將極大地約束類器官的高速發(fā)展和臨床成果轉(zhuǎn)化. 類器官制造過程階段的工程掌控也是迫切需要解決的問題. 現(xiàn)階段培養(yǎng)類器官主要采用Matrigel 水凝膠作為培養(yǎng)基質(zhì). Matrigel 是康寧生命科學(xué)公司生產(chǎn)的一種Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的膠狀蛋白混合物, 因含有外源動物成分, 難以應(yīng)用于人的很多治療場景. 另外, 即使現(xiàn)有將類器官與微流控技術(shù)進(jìn)行結(jié)合的研究例子, 但是采用微流控芯片對類器官生存的流體環(huán)境進(jìn)行模擬的方法有待進(jìn)一步提升, 怎樣操作微流控等技術(shù)監(jiān)測控制類器官培養(yǎng)過程中流體微環(huán)境仍是亟需解決的問題.另外, 目前培養(yǎng)出的類器官直徑為100～500 μm, 雖然具備一定程度的尺度效應(yīng), 但仍然未能模擬人體組織、器官的狀態(tài), 如需培養(yǎng)尺寸更大的類器官, 其血管化問題亟待解決.

2 骨/軟骨類器官

骨與軟骨是構(gòu)成身體支架的器官, 分別以骨組織和軟骨組織為主要結(jié)構(gòu)成分. 在人的一生中, 這兩種組織尤其是骨組織不斷更新和改建, 以適應(yīng)成年前機(jī)體的生長發(fā)育和成年后機(jī)體支撐功能的變化需求. 骨由骨組織、骨膜及骨髓等構(gòu)成. 骨組織由大量鈣化的細(xì)胞間質(zhì)及數(shù)種細(xì)胞組成, 堅(jiān)硬且有一定韌性. 鈣化的細(xì)胞間質(zhì)稱為骨基質(zhì). 細(xì)胞有骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞4 種, 其中位于骨基質(zhì)內(nèi)的骨細(xì)胞最多, 其余3 種細(xì)胞均位于骨組織的邊緣. 軟骨組織由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成. 根據(jù)軟骨組織所含纖維的不同, 軟骨分為透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨3 種. 軟骨是固態(tài)的結(jié)締組織, 略有彈性, 能承受壓力和耐磨擦, 有一定的支持和保護(hù)作用(見圖2).

圖2 骨/軟骨結(jié)構(gòu)組成示意圖Fig.2 Schematic diagram of bone and cartilage structure composition

骨/軟骨疾病是常見病、多發(fā)病, 具有起病隱匿、時(shí)間長等特點(diǎn), 其預(yù)防和治療往往被忽視. 目前, 骨/軟骨疾病存在如下問題亟待解決:

(1) 研究難度大. 骨/軟骨組織和細(xì)胞種類繁多, 且細(xì)胞間相互作用極為復(fù)雜; 相對于軟組織, 骨骼硬組織研究的難度較大.

(2) 治療藥物和技術(shù)滯后. 受限于機(jī)制不清, 骨/軟骨疾病治療的藥物極為缺乏, 且絕大多數(shù)骨/軟骨疾病缺少有效治療藥物; 現(xiàn)有治療以緩解癥狀為主, 無法真正逆轉(zhuǎn)或延緩疾病進(jìn)展.

(3) 組織工程研究進(jìn)入瓶頸. 骨修復(fù)新材料研究周期長、成本高; 種子細(xì)胞和細(xì)胞因子選擇在安全性和作用機(jī)理方面存在爭議; 骨組織工程難以解決血管化難題, 無法用于修復(fù)大段骨缺損.

目前, 迫切需要開發(fā)新的研究工具和技術(shù), 以較小成本和簡單方式模擬骨/軟骨的結(jié)構(gòu)和生理功能, 在特定條件下能夠模擬疾病發(fā)生過程, 復(fù)制病理特點(diǎn), 用于發(fā)病機(jī)制研究和促進(jìn)再生修復(fù). 可以說, 骨/軟骨類器官應(yīng)運(yùn)而生.

骨/軟骨類器官是體外培養(yǎng)的、含有一種以上細(xì)胞類型的微型組織, 表現(xiàn)出骨/軟骨的某些生理特征. 應(yīng)用3D 培養(yǎng)技術(shù)將干細(xì)胞誘導(dǎo)特定譜系分化, 自我組裝, 形成與骨/軟骨組織細(xì)胞排布相似的微組織, 具有骨/軟骨特有功能. 骨/軟骨類器官能夠在體外實(shí)現(xiàn)自我更新和自我組織, 這是其區(qū)別于傳統(tǒng)體外組織培養(yǎng)的關(guān)鍵. 自我更新意味著干細(xì)胞能夠不斷克隆增殖產(chǎn)生子代細(xì)胞替代衰老和死去的細(xì)胞, 自我組織意味著干細(xì)胞能夠模擬體內(nèi)情況進(jìn)行自我分化并形成空間特征化結(jié)構(gòu), 進(jìn)而模擬體內(nèi)骨/軟骨相應(yīng)功能.

2.1 發(fā)展歷程

相比于其他組織, 骨/軟骨類器官研究尚在起步階段. 由于運(yùn)動系統(tǒng)內(nèi)干細(xì)胞起源復(fù)雜, 種類和功能各異, 分化路徑不明確, 并且疾病種類多、病因復(fù)雜、周期長, 因此, 類器官構(gòu)建具有相當(dāng)難度. 2017 年Iordachescu 等[15-16]首先提出了骨類器官概念, 將成骨細(xì)胞加入含磷酸鈣的纖維素凝膠之中, 成骨細(xì)胞能夠自發(fā)形成類似天然骨的多級結(jié)構(gòu)和骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò), 模擬鈣鹽沉積及骨成熟多個階段. 引入破骨細(xì)胞后同時(shí)具備了骨形成和骨吸收功能, 能夠模擬正常骨改建過程. 隨后Akiva 等[17]、Park 等[18]、O’Connor 等[19]、Nilsson 等[20]等通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)、人骨膜衍生細(xì)胞(human periosteum-derived cell, hPDC) 等分別構(gòu)建出能夠模擬骨形成的骨類器官. Abraham 等[21]使用兒童捐獻(xiàn)者的軟骨組織酶解后構(gòu)建了軟骨類器官, 可模擬關(guān)節(jié)炎癥. Tam 等[22]使用iPSC 誘導(dǎo)軟骨分化構(gòu)建了軟骨類器官. Xie 等[23]通過將BMSC 分散在GelMA 水凝膠微球之后培養(yǎng)得到骨痂類器官, 回植后可快速修復(fù)兔子大段骨缺損. Zhang 等[24]繪制了首個骨髓組織圖譜, 為骨髓類器官的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ).

2.2 構(gòu)建策略

2.2.1 骨類器官

2022 年, 生物材料領(lǐng)域頂級期刊Bioactive Materials 首次總結(jié)了骨類器官相關(guān)研究并展望了其潛在用途[25]. 骨類器官指以類骨基質(zhì)生物活性材料為支架, 通過體外3D 培養(yǎng)結(jié)合定向誘導(dǎo)技術(shù), 將各類干細(xì)胞(如骨骼干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等) 或功能細(xì)胞(成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等) 培育組裝成為具有骨空間特征的類骨組織, 能夠模擬骨生理和病理特征, 具備骨的某些特定功能, 可用于骨骼發(fā)育和調(diào)控機(jī)制研究, 藥物篩選和骨組織再生修復(fù)[26](見圖3). 盡管已有多種類器官成功構(gòu)建, 但是骨類器官研究尚處于起步階段. 從分化調(diào)控角度, 骨形成具有長程性, 在不同時(shí)間剖面, 參與骨形成的細(xì)胞并不完全相同. 比如在編織骨形成階段, 以間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC) 及其成骨分化發(fā)揮主要作用; 而在骨小梁形成過程中, 破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收及破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞對話是骨形成關(guān)鍵, 不同階段需要給予不同外部刺激誘導(dǎo)細(xì)胞分化. 此外, 區(qū)別于其他類器官, 骨類器官應(yīng)具有類骨組織支架結(jié)果以提供力學(xué)支撐和空間化仿生結(jié)構(gòu).

圖3 骨類器官構(gòu)建示意圖Fig.3 Schematic diagram of bone organoids construction

根據(jù)報(bào)道, 構(gòu)建骨類器官有2 種方法: 直接構(gòu)建法和間接構(gòu)建法, 前者通過骨形成相關(guān)細(xì)胞形成類骨樣結(jié)構(gòu), 后者誘導(dǎo)干細(xì)胞形成軟骨, 軟骨再發(fā)生礦化形成骨組織.

(1) 直接構(gòu)建法. 根據(jù)成年后骨塑建/骨改建理論, 通過在支架材料上接種成骨前體干細(xì)胞、成骨細(xì)胞或破骨前體細(xì)胞, 通過誘導(dǎo)使細(xì)胞與材料發(fā)生自組裝, 形成類骨樣結(jié)構(gòu), 中間不經(jīng)歷軟骨階段. Iordachescu 等[15]于2017 年最早提出骨類器官概念, 通過應(yīng)用含磷酸鈣的纖維素凝膠系統(tǒng), 加入成骨細(xì)胞自我組裝成類骨樣結(jié)構(gòu), 再現(xiàn)了鈣鹽沉積及骨成熟多個階段, 得到類似天然骨的多級結(jié)構(gòu)和骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò). 他們通過介于2 個磷酸鈣陶瓷錨之間的纖維蛋白凝膠模型, 提出了骨形成的自組織結(jié)構(gòu)模型(見圖4). 可以看出: 纖維蛋白支架在培養(yǎng)的第1 周圍繞保留點(diǎn)進(jìn)行重組, 無細(xì)胞發(fā)育的對照類器官在7 d 后顯示出小幅收縮, 但仍保持扁平凝膠狀, 未組裝成3D 結(jié)構(gòu)(見圖4(a)); 2 個錨點(diǎn)之間張力導(dǎo)致6 d 之前的細(xì)胞對齊排列, 10 d 后在整個結(jié)構(gòu)中觀察到礦化結(jié)核(見圖4(b)); 7 d 后礦床不明顯，但4 d 后可以在靠近磷酸鈣源的地方觀察到個別礦化點(diǎn)(見圖4(c)); 14 d 時(shí)可見纖維蛋白框架發(fā)生變化, 從錨定區(qū)域向中心形成明顯基質(zhì), 直到3 個月時(shí)類器官完全被新基質(zhì)覆蓋(見圖4(d)). 植入這些結(jié)構(gòu)中的股骨骨膜細(xì)胞會有序沉積基質(zhì), 該基質(zhì)在化學(xué)(膠原蛋白: 礦物質(zhì)比例) 和結(jié)構(gòu)方面與成熟骨非常相似. 拉曼光譜和X 射線衍射證實(shí)該礦物是與膠原蛋白相關(guān)的羥基磷灰石. 二次諧波成像表明, 膠原蛋白的組織方式與成熟的小鼠股骨相似. 納米計(jì)算機(jī)斷層掃描證實(shí), 分化至骨細(xì)胞期的細(xì)胞通過小管連接, 并在整個培養(yǎng)過程中保持活力. 該模型可用于研究骨形成.

圖4 骨器官的早期構(gòu)建Fig.4 Early construction of bone organoids

之后, Iordachescu 等[16]選取牛股骨小梁顆粒作為系統(tǒng)基礎(chǔ), 將成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞同時(shí)種植在股骨頭微型小孔, 應(yīng)用破骨細(xì)胞分化因子(receptor activator nuclearfactor κβ ligand,RANKL) 及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) 刺激破骨形成, 應(yīng)用類固醇及β-甘油磷酸酯促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化, 成功構(gòu)建微米級骨類器官, 置入模擬失重環(huán)境中成功模擬失重導(dǎo)致的骨丟失(見圖5). 由圖5(a)可以看出: 骨組織由小梁組成, 形成致密的骨骼; 骨組織高度礦化, 由磷酸鈣組成, 蛋白質(zhì)含量很少, 在骨髓腔中檢測硫酸鹽含量. 由圖5(b) 可以看出, 股骨頭由骨小梁組成(黑框), 適合承受較大機(jī)械負(fù)荷. 為確保骨類器官的解剖學(xué)相關(guān)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 使用來自股骨頭熱處理后的微小梁顆粒(500～1 000 μm). 這些顆粒呈現(xiàn)出骨的層狀結(jié)構(gòu)(見圖5(d)) 和表面形貌(見圖5(e)), 對于正常細(xì)胞傳感和附著必不可少. 它們還具有骨相關(guān)的生化成分, 由磷酸鈣相(micro-XRF) 組成(見圖5(f)). X 射線衍射分析證實(shí)這些是由成熟的骨礦物質(zhì)羥基磷灰石(紅色條) 的生物衍生相組成(見圖5(g)). 微小梁天然具有高度靜電, 可用于插入液體細(xì)胞懸浮液滴以生成微型骨. 懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)用于懸浮小梁和原代雌性骨效應(yīng)細(xì)胞, 并通過重力沉降直接附著到骨小梁表面(見圖5(h)). 該模型將原代成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞接種到股骨頭微小梁, 隨后插入模擬微重力生物反應(yīng)器(NASA-synthecon)以模擬減少機(jī)械刺激的病理狀態(tài). 與靜態(tài)對照組相比, 模擬微重力組破骨細(xì)胞骨吸收位點(diǎn)形態(tài)發(fā)生改變. 暴露于微重力5 d 可觀察到大量骨丟失. 在構(gòu)建的類器官中可觀察到大的骨細(xì)胞突起和管狀結(jié)構(gòu)以及新基質(zhì)生成, 可用于研究骨改建過程, 揭示病理性骨質(zhì)流失和骨骼重塑疾病機(jī)制.

圖5 含磷酸鈣的纖維素凝膠骨類器官構(gòu)建Fig.5 Construction of cellulose gel bone organoids containing calcium phosphate

Akiva 等[17]利用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC) 接種在多孔3D 絲素蛋白支架, 通過旋轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器持續(xù)攪拌進(jìn)行機(jī)械刺激, 而成骨細(xì)胞根據(jù)分化階段完成自組裝, 骨細(xì)胞嵌入產(chǎn)生的礦化細(xì)胞外基質(zhì)中并能夠進(jìn)行細(xì)胞間通訊(見圖6). 熒光免疫組織化學(xué)成像顯示標(biāo)記(見圖6(a)～(c)) 為成骨細(xì)胞形成的早期階段,圖6(d)～(f) 為成熟成骨細(xì)胞, 圖6(g)～(i) 為骨細(xì)胞發(fā)育, 其中紅色為細(xì)胞質(zhì), 藍(lán)色為細(xì)胞核.圖6(a)～(i)中, 綠色分別為RUNX2 (第7 天)、OSX (第7 天)、ALP (第26 天)、骨鈣素(第26天)、骨橋蛋白(第26 天)、骨黏連蛋白(第21 天)、DMP1 (第28 天)、podoplanin (第28 天)和硬化素(第28 天). 圖6(j) 為MSCs 分化成成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的示意圖, 表明在圖6(a)～(i)中預(yù)期蛋白質(zhì)表達(dá)的狀態(tài). 熒光圖像表明8 周后嵌入礦化基質(zhì)中的骨細(xì)胞的自組織結(jié)構(gòu)域, 骨細(xì)胞(硬化素, 紅色) 和礦物質(zhì)(鈣黃綠素, 綠色) 的共定位見圖6(k). 圖6(l) 中膠原蛋白(紅色) 和礦物質(zhì)(鈣黃綠素, 綠色) 表示絲素蛋白支架. 該系統(tǒng)在體外模擬了骨形成的早期狀態(tài),該階段破骨細(xì)胞及骨改建尚未發(fā)生作用. 當(dāng)機(jī)械力模擬人體骨骼形成所需壓力時(shí), 骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞和生長調(diào)節(jié)骨細(xì)胞, 細(xì)胞還分泌完成后續(xù)功能所需所有蛋白質(zhì). 經(jīng)過4 周培養(yǎng), 研究人員最終獲得了由骨質(zhì)結(jié)構(gòu)相互交織的微型圓柱體, 隨后被更成熟的骨組織替代. 利用這種工具, 研究人員可以在分子水平研究成骨過程中可能出現(xiàn)的問題.

圖6 hBMSCs 分化為成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞Fig.6 Differentiation of hBMSCs into osteoblasts and osteocytes

Park 等[18]使用仿骨小梁脫礦質(zhì)骨質(zhì)構(gòu)建骨小梁類器官研究局部骨改建, 采用脫礦質(zhì)皮質(zhì)骨薄片復(fù)制了未礦化的骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM). 這種生物材料被命名為脫礦質(zhì)骨粉(demineralized bone powder, DBP). DBP 機(jī)械耐用、半透明, 并且具有可控的厚度和表面積. 他們研究了DBP 是否能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成礦化骨組織并獲得骨襯細(xì)胞表型, 共培養(yǎng)原代鼠成骨細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞, 使用細(xì)胞因子刺激來重現(xiàn)骨重塑周期, 實(shí)現(xiàn)了DBP 表面同時(shí)含有活性和靜息狀態(tài)成骨細(xì)胞, 最后對細(xì)胞活動進(jìn)行了定量空間映射以研究如何調(diào)節(jié)局部骨重塑活動. 結(jié)果顯示, DBP 能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生快速結(jié)構(gòu)性礦化, 成骨細(xì)胞有效轉(zhuǎn)化為內(nèi)襯細(xì)胞. 當(dāng)加入激活骨改建的刺激后, 成骨細(xì)胞分泌RANKL, 添加的單核/巨噬細(xì)胞成功分化為破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收. 該模型有效地模擬了體內(nèi)骨改建, 有助于研究調(diào)節(jié)因子時(shí)空分布在局部骨改建中的作用(見圖7). 圖7(a) 模擬了骨重塑周期順序. 由圖7(b) 可知, D3 和PGE2 刺激DBP 上的骨襯細(xì)胞導(dǎo)致RANKL/OPG 分泌比暫時(shí)增加. 熒光圖像(見圖7(c))顯示, 激活的成骨細(xì)胞(osteoblas, OB) (綠色) 誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞(紅色) 分化為破骨細(xì)胞(osteoclast, OC). 圖7(d) 證實(shí)破骨細(xì)胞可吸收礦物質(zhì). 由圖7(e) 可知, 在DBP 和TCP 上,受刺激的OB 遷移速度比未受刺激的OB 快2 倍. 由圖7(f) 可知, DBP 和TCP 上單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中OC 遷移. 在DBP 上, OC 經(jīng)歷細(xì)胞分裂和細(xì)胞融合(見圖7(g)). 在TCP 上, OB很容易被大型多核OC 推動, 而在DBP 上OB 保持原位(見圖7(h)). 在TCP 上, OC 反復(fù)進(jìn)行細(xì)胞融合, 直到細(xì)胞變得巨大并經(jīng)歷細(xì)胞凋亡. 細(xì)胞凋亡后, OC 的大肌動蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)阻止相鄰OB 遷移(見圖7(i)). 圖7(j) 為OB 堿性磷酸酶(ALP) 染色和定量比較. 圖7(k) 為多核OC 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 染色和定量比較(?p<0.05,??p<0.01, ns, 不顯著).

圖7 構(gòu)建骨類器官模擬骨改建中骨形成/骨吸收Fig.7 Construction of bone organoids structures simulating bone formation/resorption in bone remodeling

(2) 間接構(gòu)建法. 軟骨內(nèi)成骨是大多數(shù)骨組織(包括四肢骨、軀干骨及顱底骨等) 發(fā)育和再生的主要機(jī)制. 另外一種骨類器官構(gòu)建策略為先誘導(dǎo)干細(xì)胞形成軟骨, 軟骨再發(fā)生礦化形成骨組織. 為了模擬自然愈合和體內(nèi)骨再生過程, 有人提出了“發(fā)育工程(developmental engineering)” 的概念, 即通過模擬軟骨內(nèi)成骨過程中的關(guān)鍵發(fā)育事件來促進(jìn)有效骨組織再生.在軟骨內(nèi)成骨過程中, 間充質(zhì)干細(xì)胞在缺損部位聚集, 分化形成“骨痂(callus)” 軟骨核心, 隨后骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大、鈣化和凋亡, 成骨祖細(xì)胞募集并向成骨方向分化.

在骨軟骨組織工程中, 小鼠多能誘導(dǎo)干細(xì)胞iPSC(miPSCs) 可以通過轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGFβ) 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphological protein 2,BMP2) 誘導(dǎo)軟骨形成和向成骨譜系特異性分化. O’Connor 等[19]報(bào)道了一種通過iPSC培養(yǎng)骨軟骨類器官的方法. 研究人員從小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSC) 中開發(fā)了一種骨軟骨類器官. 將iPSC 時(shí)間依賴性連續(xù)暴露于生長因子(TGFβ3、BMP2), 通過軟骨內(nèi)骨化反映構(gòu)建效果. 培養(yǎng)獲得包括軟骨區(qū)域和鈣化骨區(qū)域骨類器官,該類器官可以模擬骨關(guān)節(jié)炎特點(diǎn), 進(jìn)行關(guān)節(jié)疾病藥物篩選和遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估.

Nilsson 等[20]提出了一種應(yīng)用人骨膜衍生細(xì)胞(human periosteum-derived cell, hPDC)自組裝構(gòu)建骨痂類器官的方法(見圖8). 圖8(a) 為從細(xì)胞聚集、凝聚和分化開始的示意圖.圖8(b) 為隨時(shí)間推移微球體的投影面積(87～400 個微球體, 10～90 百分位數(shù)). 圖8(c) 表示隨時(shí)間微球體代表性明場圖像. 圖8(d) 表示隨時(shí)間DAPI (核) 和鬼筆環(huán)肽(F-肌動蛋白) 染色共焦圖像代表性3D 渲染. 圖8(e) 表示微球體DNA 定量. 圖8(f) 表示活(綠色)/死(紅色) 染色. 圖8(g) 表示微球體中細(xì)胞增殖半定量. 圖8(h) 表示隨時(shí)間微球體中增殖細(xì)胞代表性熒光圖像, 其中藍(lán)色代表細(xì)胞核. hPDC 長期培養(yǎng)遵循軟骨內(nèi)骨化的早期模式, hPDC 自組裝獲得軟骨微球體, 隨后發(fā)生骨化. 該類器官還可以融合為更大組織, 用來治療較大范圍骨缺損. 由于在骨折愈合過程中形成“軟骨痂” 的大多數(shù)細(xì)胞都來自骨膜, 因此hPDCs 在長骨缺損的再生中有很大的應(yīng)用前景. 此外該研究表明, 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比, hPDC 能夠提高骨再生能力. hPDCs 可自組裝, 在植入時(shí)形成骨微器官, 基因表達(dá)模式與胚胎生長板和骨折愈合過程相似. 多個骨痂類器官組合可形成大骨器官, 有效促進(jìn)大段骨缺損小鼠骨缺損修復(fù).

圖8 人骨膜衍生細(xì)胞自組裝構(gòu)建骨痂類器官Fig.8 Self-assembly of hPDC to construct bone callus organoids

浙江大學(xué)Xie 等[23]報(bào)道了體外高效構(gòu)建骨痂類器官用于大段骨缺損修復(fù). 研究團(tuán)隊(duì)通過數(shù)字光處理(digital light processing, DLP) 打印技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了負(fù)載有BMSC 的水凝膠微球的高效生產(chǎn)和BMSC 在微球中的聚集. 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化3 周后, 構(gòu)建出與發(fā)育過程中相似的骨痂類器官(osteo-callus organoids). 研究者發(fā)現(xiàn)體外逐漸成熟過程中骨愈傷組織類器官的表型基因表達(dá)模式與天然軟骨內(nèi)骨化類似. 此外, 將骨-愈傷組織類器官植入體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其具備高效的異位骨形成和原位骨再生能力, 有助于大段骨缺損4 周內(nèi)快速原位骨再生,以往類似缺損修復(fù)通常需要3 個月.

以上2 種生物構(gòu)建策略存在周期長、成本高、重復(fù)性差等缺陷. 浙江大學(xué)Zhao 等[27]發(fā)明了一種新型的氣流輔助3D 生物打印方法, 并成功構(gòu)建多細(xì)胞骨類器官. 通過氣流輔助3D 生物打印方法, 研究團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建多細(xì)胞骨類器官. 該研究以水凝膠微球體為培養(yǎng)載體, 分別植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行成骨及成血管誘導(dǎo). 培養(yǎng)10 d 后, 可以觀察到明顯血管化的骨組織. 與常規(guī)生物制造方法不同, 該研究首次利用數(shù)學(xué)建模及機(jī)械手段, 實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)的可控成型, 為構(gòu)建骨類器官提供了新思路.

2.2.2 軟骨類器官

目前, 軟骨類器官的構(gòu)建有2 種方法: 消化獲得軟骨細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞.

(1) 消化獲得軟骨細(xì)胞. Abraham 等[21]從兒童捐獻(xiàn)者獲得骨及軟骨組織, 酶解獲得細(xì)胞后分別進(jìn)行骨及軟骨類器官構(gòu)建. 為了更好模擬關(guān)節(jié)發(fā)育及疾病狀態(tài), 該團(tuán)隊(duì)還將同時(shí)含有骨和軟骨成分的肋骨消化獲得的細(xì)胞進(jìn)行骨-軟骨誘導(dǎo)分化, 最終獲得含有骨和軟骨組織的迷你關(guān)節(jié)球. 該模型成功模擬關(guān)節(jié)炎癥, 能夠?qū)λ幬锆熜нM(jìn)行評價(jià).

(2) 誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞. Tam 等[22]研究了人多能干細(xì)胞的體外和體內(nèi)軟骨和骨組織形成能力(見圖9). 誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可定向分化為軟骨細(xì)胞, 隨后自組裝成軟骨類器官.分化形成的軟骨細(xì)胞表達(dá)與原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相似水平的Ⅱ型膠原蛋白, 并在體內(nèi)異位植入時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定軟骨. 在針對性地促肥大和促炎介質(zhì)啟動后, 類器官成功橋接了免疫功能低下小鼠的臨界尺寸長骨缺損.

圖9 人多能干細(xì)胞衍生的軟骨類器官促進(jìn)長骨缺損無支架愈合Fig.9 Human pluripotent stem cell-derived cartilage organoids promote scaffold-free healing of long bone defects

2.3 應(yīng)用前景

骨/軟骨類器官基于3D 體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)建立, 與體內(nèi)骨/軟骨結(jié)構(gòu)高度相似, 可以復(fù)制出骨/軟骨的復(fù)雜空間形態(tài)和功能, 表現(xiàn)出細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用和空間位置形態(tài), 與體內(nèi)骨/軟骨具有相似生理反應(yīng). 基于以上優(yōu)勢, 骨/軟骨類器官能夠在發(fā)育生物學(xué)、生物樣本庫、藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)、疾病建模等領(lǐng)域有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)骨組織工程的不足, 在骨/軟骨再生修復(fù)研究中具有巨大潛力(見圖10).

圖10 骨/軟骨類器官的轉(zhuǎn)化應(yīng)用場景Fig.10 Translational application scenarios of bone/cartilage organoids

首先, 骨/軟骨類器官能夠模擬體內(nèi)代謝和再生修復(fù)過程, 有助于闡明骨/軟骨在各種生理病理狀態(tài)下再生修復(fù)機(jī)制. Park 等[18]構(gòu)建的骨類器官模型可以模擬體內(nèi)骨改建這一復(fù)雜過程. 在此基礎(chǔ)上, 構(gòu)建病理?xiàng)l件下骨類器官, 模擬骨微環(huán)境特點(diǎn), 在體外可直觀研究疾病狀態(tài)下骨改建規(guī)律. 在骨類器官上制作骨折、缺損模型, 可動態(tài)連續(xù)研究骨類器官缺損修復(fù)機(jī)制.其次, 骨/軟骨類器官能夠用于材料和藥物快速篩選. 傳統(tǒng)骨組織工程材料支架、種子細(xì)胞和生長因子的篩選主要依賴體內(nèi)研究評價(jià), 周期長、干擾多、成本高. 通過骨類器官可實(shí)現(xiàn)體外高通量快速篩選骨組織工程所需材料, 有效避免盲目設(shè)計(jì)與測試, 節(jié)約大量時(shí)間和資源. 最后,骨/軟骨類器官本身可直接用于骨/軟骨組織修復(fù)再生, 其研究目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)大尺度宏觀骨/軟骨類器官的制備, 可直接用于骨/軟骨缺損原位修復(fù).

3 總結(jié)與展望

骨/軟骨在人體生理活動中發(fā)揮重要功能. 骨/軟骨疾病種類多、起病慢、病程長、危害大,現(xiàn)在尚缺乏有效治療手段. 由于缺乏簡單高效的研究模型, 目前骨/軟骨疾病研究仍有大量問題尚不明確, 如骨/軟骨干細(xì)胞的鑒定和分離方法、骨/軟骨微環(huán)境結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分的解析等.骨/軟骨類器官的構(gòu)建和應(yīng)用為臨床解決上述問題提供了新的研究工具和技術(shù), 其以較小成本和簡單方式仿生骨/軟骨的結(jié)構(gòu)和生理功能, 在特定條件下能夠模擬疾病發(fā)生過程, 復(fù)制病理特點(diǎn), 高效用于骨/軟骨發(fā)病機(jī)制和再生修復(fù)的研究.

展望未來, 骨/軟骨類器官研究前景巨大. 該技術(shù)作為一種新型工具, 在骨/軟骨基礎(chǔ)研究和臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用前景, 有望被應(yīng)用在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、藥物毒性和療效、生物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域.這項(xiàng)技術(shù)也為再生醫(yī)學(xué)提供了巨大的潛力, 通過用骨/軟骨類器官培養(yǎng)物替換受損或患病的骨/軟骨組織, 可突破傳統(tǒng)骨組織工程修復(fù)極限. 與此同時(shí), 骨/軟骨類器官有望為再生醫(yī)學(xué)研究創(chuàng)造出更多的新成果. 將活體實(shí)時(shí)成像技術(shù)應(yīng)用在骨/軟骨類器官中, 將首次實(shí)現(xiàn)人體骨/軟骨組織發(fā)育進(jìn)程的實(shí)時(shí)觀察; 將骨/軟骨類器官與生物3D 打印結(jié)合,將實(shí)現(xiàn)骨/軟骨組織損傷的空間特征化功能修復(fù); 將骨/軟骨類器官與“人類細(xì)胞圖譜(human cell atlas, HCA)” 技術(shù)結(jié)合, 骨/軟骨類器官細(xì)胞圖譜將能加速多種骨/軟骨相關(guān)罕見病等的治療進(jìn)程.

綜上所述, 骨/軟骨類器官研究意義重大, 應(yīng)用前景廣泛, 但目前尚處于起步階段, 需要解決包括細(xì)胞外基質(zhì)材料、干細(xì)胞種類、來源及誘導(dǎo)條件等諸多問題, 方能將骨/軟骨類器官真正推向臨床應(yīng)用, 造福廣大患者.