非編碼RNA 調控肝癌的研究進展

楊芊芊, 田 慧, 王廣志, 馬中良

(1. 上海大學生命科學學院非編碼RNA 與癌癥實驗室, 上海 200444;2. 復旦大學附屬中山醫院, 上海 200032;3. 濰坊醫學院附屬醫院, 山東濰坊 261053)

肝癌是一種致命的惡性腫瘤,根據腫瘤權威期刊A Cancer Journal for Clinicians: Cancer Statistic 的最新報道, 肝癌的發病率男性居第五位, 女性居第七位, 而在我國高居惡性腫瘤發病率的第二位, 因此人們面臨肝癌問題形勢嚴峻[1]. 肝癌分為原發性肝癌和轉移性肝癌,而在原發性肝癌中最常見的是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC), 占原發性肝癌的75%～85%. 肝癌的發病率高、轉移性強、預后較差, 并且大多數肝癌被診斷出時已是晚期, 因此手術切除和肝移植不是實際的治療選擇[2], 需要進一步尋找治療肝癌的更好辦法.

腫瘤與腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME) 的相互作用在腫瘤發生和發展中起著關鍵作用[3]. TME 是指腫瘤細胞周圍的微環境, 在腫瘤發展過程中, 組織中的生理氧或常氧濃度受到阻礙, 導致TME 中的氧濃度低, 稱為缺氧[4]. 缺氧是TME 的典型特征, 也是癌癥的標志, 它通過影響細胞增殖、周期、代謝、血管生成、耐藥性或侵襲、遷移和轉移等途徑, 在致瘤性中發揮關鍵作用[5-8].

非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA) 是一類不編碼蛋白質但具有重要調控功能的RNA 分子. ncRNA 包括microRNA (miRNA)、長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA) 和環狀RNA (circular RNA, circRNA) 等. miRNA 是一類獨特的小ncRNA, 在基因表達的轉錄后調控中發揮著至關重要的作用[9]. lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸且缺乏編碼蛋白質能力的RNA[10], 其異常表達與癌癥的發生、發展和預后密切相關[10-11].circRNA 是一類高度保守、穩定和豐富的ncRNA, 可在轉錄或轉錄后水平調節基因表達[12].研究表明, ncRNA 在多種癌癥中異常表達, 與腫瘤發生和轉移密切相關, 因此被認為是癌癥的新型生物標志物和治療靶點(見圖1).

圖1 ncRNA 對HCC 發生發展的調控Fig.1 Regulation of HCC development by ncRNA

1 缺氧TME 與HCC

1.1 缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF) 與HCC

2019 年諾貝爾生理學或醫學獎授予威廉· 凱林(William G. Kaelin)、彼得· 拉特克利夫(Peter J. Ratcliffe) 和格雷格· 塞門扎(Gregg L. Semenza), 表彰他們在低氧感應方面做出的貢獻[13]. HIF-1 轉錄因子激活是TME 中廣泛研究的途徑之一, HIF-1 有2 個亞基: 氧敏感的α-亞基(HIF-1α) 和組成型表達的β-亞基(HIF-1β)[14]. 研究發現, HIF-1α 普遍參與了肝癌的發生發展. Zheng 等[15]發現HIF-1α 過表達與較差的總生存期(overall survival, OS) 和無病生存期(disease-free survival, DFS) 有關. HIF-1α 主要參與促進腫瘤增殖、遷移、侵襲和血管形成, 以及上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)、糖酵解調節和脂質代謝等途徑, 涉及各種信號通路(見表1).

表1 HIF-1α 在HCC 中的作用及潛在機制Table 1 Role of HIF-1α in HCC and potential mechanisms

HIF-1α 通過白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)/核轉錄因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB) 促進肝癌細胞的遷移和侵襲. 此外, HIF-1α 激活的TM4SF1-AS1 通過增強TM4SF1表達在促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起重要作用. HIF-1α 誘導的EMT 是與轉移相關的關鍵過程. 活化的肝星狀細胞通過炎癥信號可以促進HCC 細胞中轉谷氨酰胺酶2(transglutaminase type 2, TGM2) 上調, 使HIF-1α 積累, 從而產生假缺氧狀態, 促進HCC細胞中的EMT. 脂質代謝的重編程已成為癌癥的標志, 最近有研究報道HIF-1α 與這一過程有關, 脂肪酸結合蛋白5 (fatty acid-binding protein 5, FABP5) 通過促進HIF-1α 合成并破壞FIH/HIF-1α 相互作用來增強HIF-1α 活性, 從而促進HCC 細胞中的脂質積累和細胞增殖.

1.2 ncRNA 與HCC 缺氧TME

基于ncRNA 的特點, 目前大多數研究集中在ncRNA 調節HCC 細胞功能和靶基因中的作用. 研究表明, ncRNA 參與細胞間通訊, 調節腫瘤免疫細胞的活化、增殖和細胞因子分泌,從而影響腫瘤的遷移、侵襲和免疫逃逸. ncRNA 在HCC 和TME 之間起著重要作用. 實體癌及其TME 通常是以缺氧為關鍵特征, 而缺氧的反應機制十分復雜. 因此, ncRNA 調節缺氧TME 的作用受到人們越來越多的關注.

靶基因受HIF-1α 調節, 以介導缺氧誘導的表型[16], 其中由缺氧信號調節的ncRNA 稱為缺氧反應性ncRNA (hypoxia-responsive ncRNA, HRN). 根據與HIF 復合物的相互作用,HRN 可分為參與HIF-1α 介導的直接調節和HIF-1α 介導的間接調節[17]. miRNA 作為研究最多的亞組, 缺氧反應性miRNA (hypoxia-responsive miRNA, HRM) 在癌癥的發生和發展中表現出有希望的致癌或腫瘤抑制功能[18]. 缺氧可以改變lncRNA 的表達, 進而通過多種機制調節HIF-1α 活性, 如染色質修飾、RNA 穩定性和蛋白質穩定性、HIF-1α 的轉錄活性調節[19]. 研究表明, lncRNA 還可作為miRNA 的競爭內源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA) 在轉錄后水平調節相關mRNA 的表達[20], 例如HIF-1α mRNA. ncRNA 可以通過多種機制在轉錄后水平介導HIF-1α, 這對于調節HIF-1α 表達至關重要(見表2).

表2 ncRNA 與HIF-1α 在肝癌中的研究進展Table 2 Research progress of ncRNAs and HIF-1α in HCC

2 ncRNA 在肝癌中的調控

2.1 miRNA

2.1.1 肝癌中的致癌性miRNA針對肝病等多種疾病中的miRNA 的研究正在逐漸擴大. 下面總結致癌性miRNA 在肝癌中的發病機制和進展中的作用(見表3).

表3 致癌性miRNA 在HCC 中的調控作用Table 3 Regulatory role of oncogenic miRNAs in HCC

miR-18a 在人類癌癥中失調并與腫瘤發展有關. miR-18a-5p 是miR-18a 的主要成熟體,在HCC 組織中顯著上調, 其表達與HCC 的預后呈負相關. 通過體外實驗驗證, miR-18a-5p表達的下調顯著抑制了HCC 細胞的進展. 機制上, miR-18a-5p 通過靶向細胞質多腺苷酸化元件結合蛋白3(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3, CPEB3) 促進HCC 細胞的進展. 該研究有助于人們更好地了解miR-18a-5p 潛在的HCC 進展機制, 也有助于尋覓有關HCC 靶向新的治療方案.

Li 等[21]探討了miR-552 在HCC 中的作用機制, 與癌旁組織相比, HCC 組織中的miR-552 的表達顯著增加, 并且該基因高表達預示著HCC 患者的預后較差. 接著, 通過細胞功能試驗表明miR-552 在HCC 細胞中發揮著顯著的致癌功能. 機制上, miR-552 通過與其直接靶點Wnt 抑制因子1 (wnt inhibitory factor 1, WIF1) 結合, 使WIF1 介導的糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)/β-catenin 信號通路的激活降低, 從而在HCC 中發揮其致癌作用.

miR-23a/24-2/27a 簇可以促進肝轉移, 為了確定其在肝癌中的調節機制, Yang 等[22]發現, 與癌旁組織相比, 肝癌組織中成熟的miR-24-2 顯著增加, 并通過體內和體外實驗證明了miR-24-2 加速肝癌細胞的生長. Hayashi 等[23]專注于miR-23b-3p 的雙重作用, 以確定它是否在HCC 組織中作為腫瘤抑制或致癌miRNA 發揮作用, 通過過表達miR-23b-3p 顯示其與腫瘤惡性和不良預后相關, 證明miR-23b-3p 在HCC 癌變過程中充當致癌miRNA, 并且線粒體鈣攝取家族成員3(mitochondrial calcium uptake family member 3, MICU3) 和烯酰輔酶A水合酶(the AU binding homolog of enoyl-CoA hydratase, AUH) 都可能是miR-23b-3p 的候選基因靶標.

2.1.2 腫瘤抑制性miRNA 和肝癌

基于miRNA 的雙重性, 總結腫瘤抑制性miRNA 在HCC 中的生物學功能, 結果見表4.

表4 腫瘤抑制性miRNAs 在HCC 中的調控作用Table 4 Regulatory role of tumor suppressor miRNAs in HCC

Furuta 等[24]發現miR-203 表達對HCC 細胞系的生長有抑制作用, 并指出miR-203 可能為腫瘤抑制因子. 聚焦于HCC 患者臨床病理特征的研究表明, miR-203 在HCC 組織中表達顯著低于在癌旁組織中的表達[25]. Zhang 等[26]發現, miR-203 過表達可以使HepG2 和Hep3B 細胞活力和細胞增殖顯著下降. 機制上, miR-203 通過直接靶向PIK3CA 下調磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt) 信號傳導, 并且miR-203 在原發性肝癌中還可調節原癌基因c-Jun 和p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK) 的表達, 從而發揮其抑癌功能.

通過分析健康供體和肝癌患者的肝組織樣本中miR-378a 的表達水平, 發現與正常肝臟樣本相比, 肝癌樣本中miR-378a 的表達水平顯著降低. 通過雙熒光實驗表明, miR-378a 靶向血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、血小板衍生生長因子受體β (platelet derived growth factor receptor β, PDGFRβ) 和c-RAF, 這3 個基因也是多靶點抑制劑索拉非尼的重要靶點. 此外, miR-378a 增強了肝癌細胞對索拉非尼的敏感性[27].

與癌旁組織相比, HCC 組織中miR-300 的表達顯著下調, 并預示著HCC 患者的不良預后. 機制上, miR-300 通過直接靶向黏附斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)/PI3K/AKT 信號通路抑制EMT 從而抑制HCC 細胞的遷移和侵襲[28]. miR-300 可通過下調腫瘤細胞周期相關蛋白(cell cycle-related and expression-elerated protein in tumor, CREPT)/Wnt/β-catenin信號通路, 抑制肝細胞癌細胞的生長[29]. 因此, miR-300 在HCC 的侵襲和轉移中起重要作用,可作為一個有前途的治療靶點.

2.2 lncRNA

lncRNA 作為癌基因或抑癌基因, 在調節HCC 的發生發展中起關鍵作用. lncRNA 除了調節靶基因外, 還可以作為miRNA 海綿競爭性結合miRNA, 從而減弱miRNA 對靶基因mRNA 的抑制作用, 間接提高靶基因mRNA 的表達水平, 這些lncRNA 被稱ceRNA[30](見圖2).

圖2 lncRNA 相關ceRNA 在HCC 中介導的功能Fig.2 lncRNA-associated ceRNA mediated functions in HCC

2.2.1 lncRNA 在細胞增殖和抗凋亡中的作用

Tang 等[31]用雙熒光素酶報告基因實驗, 證實了lncRNA 牛磺酸上調基因1(taurine upregulated gene 1, TUG1) 與miR-1-3p 之間的靶向結合關系. 從機制上看, lncRNA TUG1 可以作為ceRNA 吸附miR-1-3p, 促進胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)的表達, 促進細胞在肝癌發生中的增殖. lncRNA ASMTL-AS1 是HCC 發生和發展的關鍵調控因子, 為了確定其在HCC 惡變過程中的功能. Mou 等[32]評估了ASMTL-AS1、miR-1343-3p 和LAMC1 在HCC 組織和細胞中的表達, 發現ASMTL-AS1 和LAMC1 在HCC 組織和細胞中高表達, 而miR-1343-3p 則低度表達. 在機制中, ASMTL-AS1 海綿吸附了miR-1343-3p, 從而減弱了miR-1343-3p 對LAMC1 的3′-UTR 的靶向作用, 抑制了HCC 細胞的增殖. LINC00473 已被確認為許多癌癥的腫瘤因子, 有研究表明LINC00473 在HCC 細胞中也明顯升高. Mou 等[33]使用RNA 免疫沉淀(RNA immcenoprecipitation, RIP) 實驗證實了LINC00473 與miR-195 之間的結合相關性, 其中miR-195 是各種癌癥中著名的腫瘤抑制因子. 在體內實驗中, 結果顯示LINC00473 能夠通過抑制miR-195 作為ceRNA 來促進HCC 腫瘤的生長. 因此, LncRNA-miRNA 網絡是治療癌癥的一個有希望的目標.

2.2.2 lncRNA 在遷移、侵襲和EMT 中的作用

Li 等[34]發現一個lncRNA-LINC02362 與HCC 患者的預后良好有關. MTT (噻唑藍) 分析、EdU 標記實驗等分析表明, LINC02362 抑制了HCC 細胞的生存、遷移、侵襲和EMT. 此外, LINC02362 作為海綿調節miR-516b-5p 的內源水平, 并作為腫瘤抑制性lncRNA 發揮作用. 數據顯示, 與對照組相比, LINC01572 在HCC 組織中異常上調, 特別是在并發T2DM 的患者中[35]. LINC01572 的過量表達明顯促進了HCC 細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT,而敲除LINC01572 則有相反的效果. LINC01572 作為miR-195-5p 的ceRNA, 限制其對PFKFB4 的抑制,從而增強糖酵解,激活PI3K/AKT 信號,引發HCC 惡變.Zhou 等[36]通過CCK8、EdU、菌落形成、劃痕實驗, 測量LINC00355:8 對HCC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響. 結果表明,LINC00355:8 通過作為ceRNA 抑制miR-6777-3p 的表達來激活Wnt10b, 從而促進HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲.

2.3 circRNA

circRNA 可以代表臨床相關的生物標志物用于癌癥患者的管理[37]. 圖3 總結了近年發現的失調circRNA 及它們在HCC 中的調控功能.

圖3 circRNA 的作用及調控網絡機制Fig.3 Role of circRNA and regulatory network mechanism

2.3.1 circRNA 在細胞增殖和抗凋亡中的作用

circ-0032683 在HCC 組織中的表達顯著低于正常肝組織, 并被證明是miR-338-5p 的海綿,體外和體內功能實驗表明,其作為腫瘤抑制因子發揮作用. 在HCC 中circ-0032683 的表達減少導致miR-338-5p 活性增加, 從而其靶標神經突生長抑制劑(reticulon-4, RTN4) 的表達減少. 因此,circ-0032683 通過ceRNA 機制抑制了HCC 的增殖能力. HCC 中細胞增殖途徑的失調也可以由促癌circRNA 介導, 其中, circ-0003945 在HCC 組織中上調, 較高的circ-0003945表達與腫瘤大小和腫瘤分期呈正相關. 機制上, circ-0003945 可作為miR-34c-5p 海綿發揮作用, 上調其靶基因-富含亮氨酸重復的G 蛋白偶聯受體4 (leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 4, LGR4) 的表達, 激活β-catenin 通路, 最終促進HCC 的增殖[38].

研究證明, circ-0036412 /miR-579-3p/ GLI2 網絡可以影響HCC 的細胞周期進程.circ-0036412 在HCC 細胞中過表達, 并通過競爭性結合miR-579-3p 上調GLI2 的表達,從而促進HCC 細胞的增殖并抑制細胞周期停滯[39].

細胞凋亡是程序性細胞死亡, 對凋亡程序的研究對于闡明腫瘤發展為高度惡性和對于治療腫瘤耐藥性至關重要. 最近, 有報道稱circRNA 在調控肝癌細胞凋亡機制的信號通路中具有相關性[40]. 已有多項研究確定了可以調節細胞凋亡的circRNA(見圖3). 除此之外, Duan等[41]在HCC 中發現一種高表達的circRNA-circMAP3K4, 其可預防肝細胞癌的細胞凋亡.circMAP3K4 在HCC 中具有編碼潛力, 在N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A) 修飾的驅動下, 可編碼一個455aa 多肽circMAP3K4-455aa. circMAP3K4-455aa 通過與凋亡誘導因子線粒體相關1(apoptosis inducing factor mitochondria associated 1, AIF) 相互作用, 抑制順鉑誘導的HCC 細胞凋亡, 這可能為化療耐藥的HCC 患者提供一種新的治療策略.

2.3.2 circRNA 在侵襲、轉移和血管生成中的作用

侵襲和轉移與EMT 密切相關, EMT 是指上皮細胞從分化特性轉變為間質特性的生物學過程, 其在源自上皮細胞的惡性腫瘤細胞獲得能夠侵襲的特征能力中起著至關重要的作用[42]. 最近的研究表明, 一些EMT 相關的circRNA 可以影響HCC 的EMT 過程. 例如,circPTK2 可以調節HCC 中的EMT.研究發現,miR-92a 在HCC 組織和HCC 細胞系中上調,circPTK2 可作為miR-92a 的海綿抑制其表達, 從而下調其靶向E-鈣黏蛋白(E-cadherin) 的能力, 進而來抑制肝細胞癌中的EMT. Song 等[43]在有/無門靜脈腫瘤血栓(portal vein tumor thrombosis, PVTT) 轉移的HCC 患者中發現, circ000399 在PVTT 組織和HCC 組織中的表達顯著上調, 其表達與HCC 患者的侵襲性特征相關. 進一步研究發現, circ0003998 可以作為miRNA-143-3p 的ceRNA, 從而減輕其對FOS 樣2(FOS-like 2, FOSL2) 的抑制; 同時,circ0003998 可以與poly(rC) 結合蛋白1 (poly(rC) binding protein 1, PCBP1) 結合, 提高了EMT 相關基因CD44v6 的表達水平, 從而促進肝細胞癌中的上皮向間質轉化.

Wu 等[44]通過qRT-PCR 在HCC 中發現一種下調的circRNA-circ-0004018, 通過一系列功能試驗, 發現circ-0004018 的過表達顯著抑制了HCC 中的血管生成. 機制上, 由雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)激活的circ-0004018 通過與肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma,FUS) 結合并穩定TIMP 金屬肽酶抑制劑2(TIMP metallopeptidase inhibitor 2, TIMP2) 表達, 從而抑制HCC 中的血管生成. Yang 等[45]發現HCC 組織中circCRIM1 的表達高于相應的相鄰正常樣本, 并與預后不良有關. 進一步研究發現, circCRIM1 可以充當miR-378a-3p 的海綿從而上調其靶基因S 期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2, SKP2) 的表達, 促進肝細胞癌增殖、轉移和血管生成.

3 結論與展望

越來越多的研究證實, ncRNA 作為治療HCC 的有希望的預后生物標志物和治療靶點. 其中, 研究最多的ncRNA 是miRNA, 其中一些已被證明在HCC 中顯著失調, 促進肝腫瘤進展并與HCC 患者的預后明顯相關[46]. 此外, 不同類型ncRNA 之間的調控網絡, 如lncRNA-miRNA、circRNA-miRNA, 表明ncRNA 在TME 調控中的復雜性. 鑒于ncRNA 的組織特異性表達, 一些ncRNA 生物標志物或治療靶點可能對單一肝臟疾病具有高度特異性,從而可以快速診斷和更好地管理HCC. 這些發現為ncRNA 介導的HCC 微環境、代謝和腫瘤細胞狀態之間的相互作用提供了新的見解.

TME 在肝癌的發生和發展中起著關鍵作用. 持續的肝損傷和同時發生的再生可能會產生一個環境, 最終導致缺氧和炎癥的形成, 這是TME 關鍵特征[47-48]. 在缺氧條件下, HIF-1α是一種重要的轉錄因子, 它介導缺氧對腫瘤細胞和TME 的適應性調節的影響[49]. HCC 中HIF-1α 的表達明顯高于正常肝細胞中的表達. HIF-1α 是HCC 細胞適應缺氧微環境的關鍵調節因子, 許多研究已經證明了HIF-1α 作為治療靶點的可行性, 這表明通過直接或間接方式改變HIF-1α 活性的干預措施可能對治療HCC 有效.

已發現許多ncRNA 通過轉錄后水平調節HIF-1α 的表達, 進而調控TME. 因此, 基于抗ncRNA 的癌癥干預療法的臨床前研究受到了極大的關注, 并衍生出了一系列臨床藥物. 例如:Ghosh 等[50]通過體內和體外實驗驗證了miR-199a-3p 通過下調TME 中的趨化因子-血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGFA), 來減弱HCC 中的多個細胞間串擾, 并證明了這是一種有價值的治療HCC 的方法. miR-34a 是一種天然存在的腫瘤抑制因子, 基于miR-34a 的癌癥治療已經在晚期實體瘤患者中進行了研究[51]. 雖然由于免疫毒性, 這項基于miRNA 療法的首次人體臨床試驗提前結束, 但不能否認miR-34a 在治療HCC 原位小鼠模型中顯著抑制了腫瘤生長這一事實[52]. 因此, 在ncRNA 水平上探索和研究天然藥物對TME 的調節作用是有希望的.

由此可見, ncRNA 對肝癌的發生發展及其對TME 的調控為HCC 的探索和治療提供了新的方向, 其中基于ncRNA 的調控網絡, ncRNA 的靶基因及相關的信號通路正在成為新的藥物研發的目標. 我們相信, ncRNA 在未來可能被用作液體活檢和非侵入性生物標志物, 用于癌癥的早期檢測、診斷和治療.