3D 打印器官源脫細胞外基質血管支持補片重建腹壁的組織工程方法

張海光, 汪 輝, 胡慶夕

(上海大學機電工程與自動化學院快速制造工程中心, 上海 200444)

腹壁缺損如切口疝是外科手術中最常見的問題之一, 對腹壁缺損的治療也有不同的方法[1]. 生物材料, 特別是不可吸收的生物材料, 常用于疝修補. 聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸(polylactic acid, PLA) 等高分子材料具有優異的力學性能[2]. 然而, 由于感染(2%～3%)、腸瘺(1%～2%) 和腸梗阻(2%～5%) 等并發癥的風險, 這些高分子材料容易導致傷口的感染或污染[3]. 此外, 由于植入物缺乏組織再生, 一些患者需要再次手術來解決缺損的復發[4].

生物來源的生物材料因具有良好的生物相容性和組織再生性能而被廣泛應用于組織重建. 豬小腸黏膜下層(porcine small intestinal submucosa, PSIS) 是目前常用的生物補片支架, 其優點是具有較好的生物性能, 缺點是力學性能較差, 易發生組織粘連. 脫細胞真皮基質(acellular dermal matrix, ADM) 是一種具有良好生物相容性和力學性能的膠原樣細胞外基質材料[5-9], 不同形式的脫細胞真皮基質已被廣泛應用于燒傷、整形外科、創傷修復等方面[10-12].然而, ADM 表面結構致密, 植入后血管和新組織難以生長, 隨著材料的降解, 機械強度降低,導致疝復發. 因此, 不能單獨使用ADM 來修復大塊的腹壁缺損[13-15].

3D 打印作為一種新型制造技術, 能夠借助計算機輔助繪圖(computer aided drafting,CAD) 和計算機輔助制造(computer aided manufacturing, CAM) 軟件對組織工程支架的空間形狀和特性進行精確控制和設計[16-18]. 值得注意的是, 3D 打印的應用可以在很大程度上減少材料的浪費, 并根據體內缺陷的不同結構制備出合適形狀的組織工程支架[19-21]. 孔徑和纖維直徑的控制對于3D 空間支架非常重要. 已有研究發現, 孔徑大小在細胞黏附、分化、遷移和新組織形成中起著重要作用[22-24].

基于以上觀點, 本工作嘗試利用ADM-PLA-ADM 制備適合腹壁缺損重建的3D 打印血管支持補片. 測試了3D 打印補片的物理和機械性能、體外細胞培養條件下的細胞響應性能以及體內條件下的組織再生性能.

1 材料和方法

1.1 3D 打印ADM-PLA-ADM 生物補片支架

ADM 粉(江蘇聯合生物醫藥有限公司, 中國) 與冰醋酸(Sigma, 美國) 以1∶10 的質量體積比充分混合(見圖1(a)). 用3D 打印機(上海先鋒電子科技有限公司, 中國) 打印混合溶液. 將混合溶液在室溫下從23 號針的注射器中擠出, 氣壓泵的擠出壓力保持在4 MPa.接收平臺在G-code 命令開發的運動控制程序下沿著規定的路徑移動. ADM 層的制作工藝如圖1(b)～(c) 所示.

圖1 制備多層ADM-PLA-ADM 生物補片支架示意圖Fig.1 Schematic diagram of manufacturing multi-layer ADM-PLA-ADM biological mesh scaffold

ADM 層打印完成后, 將商用PLA 編織網放置在ADM 層上(見圖1(d)), 然后在PLA 編織網上再打印一層ADM, 形成多層補片. 最后, 將多層補片從接收平臺移出, 置于京尼平溶液中. 京尼平溶液(MedChem Express, 美國) 作為交聯劑溶于去離子水中配置成濃度為0.625%的交聯溶液. ADM-PLA-ADM 生物補片支架的制作過程如圖1(e) 所示. 將所制備的支架在室溫下放置20 min, 然后在4?C 下放置交聯完成12 h (見圖1(f)).

本工作選取臨床常用的PSIS 補片和PLA 補片作為對照樣本, 與所制備的ADM-PLAADM 生物補片支架的特性進行比較.

1.2 機械性能

為了探究所制備的ADM-PLA-ADM 生物補片支架的力學性能, 記錄每個樣品從測試開始到完全斷裂點的軸向力學數據. 使用WDW-1 材料試驗機(中國松盾機械設備有限公司) 對每個樣件以0.5 mm/min 的恒定速度進行測試, 直至補片斷裂, 上下夾距為10 mm. 兩種樣品的尺寸均為30 mm×10 mm. 用足夠強度的縫線在距離邊緣2 mm 的短端穿過補片, 縫線另一端固定在夾具上. 每組測試6 個樣品, 記錄樣品被縫線破壞時的縫合強度.

1.3 接觸角測量

ADM-PLA-ADM 生物補片支架的親水性由接觸角測角儀(中國承德試驗機廠) 測量. 用微注射器在補片表面加入5 μL 蒸餾水, 分別在沉積后0 s 和60 s 記錄ADM 層表面的水接觸角. 每種樣品重復測試6 次. 用測角儀對接觸角進行直接顯微測量.

1.4 降解特性

通過監測ADM-PLA-ADM 生物補片支架在RPMI 1640 介質(Thermo Fisher, 美國)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS) (GE Healthcare, 美國) 和人工血漿(artificial plasma, AP) (湖州InnoReAgents 生物技術有限公司, 中國) 中浸泡前后的重量變化來測試3D 打印補片的降解性能. 首先, 對ADM-PLA-ADM 生物補片支架、PLA 補片和PSIS 補片進行稱重; 然后, 將稱重的樣品放在37?C 的二氧化碳溫箱中孵化, 直到設定的時間.在每個降解階段取出標本, 用蒸餾水徹底清洗并干燥. 試驗組和對照組在真空干燥后稱量支架重量(每組n=3 個), 并記錄支架重量.

1.5 細胞毒性

研究大鼠肌原細胞(L6, 中國科學院捐贈) 在多生物補片支架和對照樣品上的增殖情況.采用CCK-8 試劑(Sigma, 美國) 測量ADM-PLA-ADM 生物補片支架、PLA 補片和PSIS 補片在不同時間點(1、3、5 d) 的細胞毒性. 將樣品(20 mm×20 mm) 浸泡在含10% 胎牛血清和1% 青霉素鏈霉素培養基中, 在培養箱中搖動24 h, 之后收集釋放的培養基.

成纖維細胞在100 μL 培養基中以2 000 細胞/孔的密度培養. 在37?C 的5% CO2培養箱中培養24 h 后, 用釋放的培養基替換成纖維細胞培養基. 再培養24 h 后, 每孔加入10 μL CCK-8 溶液, 用96 孔板再孵育1.5 h. 用微板閱讀器(Infinite 200 Pro, Tecan Group Ltd., 瑞士) 在450 nm 處用熒光法測定吸光度.

1.6 動物實驗

雄性SD 大鼠6 只(200 g, 上海交通大學醫學院附屬上海第九人民醫院動物實驗中心), 吸入異氟醚, 麻醉后消毒腹壁, 在腹壁中部造25 mm×25 mm 的腹壁肌肉組織缺損. 選擇PLA補片作為對照組, 使用ADM-PLA-ADM 生物補片支架進行橋接修復, 修復后閉合皮膚. 4 周后處死大鼠, 觀察腹壁修復及腹壁粘連情況[25].

1.7 統計分析

采用Origin 2017 軟件進行統計分析. 所有數據均以均數± 標準差(standard deviation,SD) 表示, 并采用單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA), 以確定哪些群體存在顯著差異. 當p<0.05 時, 認為差異有統計學意義.

2 實驗結果

2.1 3D 打印補片的形貌特征

本工作制備的ADM-PLA-ADM 生物補片支架的形態如圖2 所示. 支架的多孔結構使支架內的微觀結構更加豐富多樣(見圖2(b)), 這可以促進培養液的灌流, 維持較高的細胞存活率. ADM 層的表面比PLA 支架表面粗糙得多(見圖2(c)), 這有利于細胞附著和增殖. 復合材料支架的橫斷面圖像顯示了多層結構, 層與層之間沒有空隙(見圖2(d)), 這證明采用本工作提出的方法制備具有結構穩定、粘連層充足的復合材料支架的可行性. 根據ADM 層表面和內部的掃描電子顯微鏡圖片, 利用Origin 軟件定量測量支撐材料中的纖維直徑和孔徑. 結果表明, 3D 打印工藝制備的ADM 層的纖維直徑和孔徑分布具有以下特點: 大約80% 的ADM 纖維直徑在300～360 μm 之間, 92% 的孔洞直徑在300～500 μm 之間, 這可能有利于細胞附著增殖[26-27].

圖2 3D 打印生物補片支架形貌特征圖Fig.2 3D printing biological mesh scaffold morphology feature map

2.2 機械性能

ADM-PLA-ADM 生物補片支架的縫合和拉伸性能是臨床組織重建的關鍵參數. 良好的縫合強度保證了支架植入后不會與自體組織分離, 也保證了支架在初始階段的穩定性. 采用載荷-位移曲線和應力-應變曲線來確定試樣的力學性能, 結果如圖3 所示. 由圖可知, 由于ADM-PLA-ADM 補片支架的橫截面積較大, 使得其應力小于其他補片, 平均縫合載荷為18.05 N, 可以滿足臨床公認的抗拉強度標準[28].

圖3 支架力學性能測試結果Fig.3 Mechanical property test results of support

2.3 接觸角測量

圖4 為液滴在沉積時刻的瞬間形態. 由于ADM-PLA-ADM 生物補片支架孔隙率大,接觸角為0?, 沉積0 s 后ADM 層的平均接觸角為61?±4?, 沉積60 s 后降為42?±6?. PSIS 補片沉積0 s 后平均接觸角為78?±3?, 沉積60 s 后平均接觸角為58?±5?. PLA 補片沉積0 s 后平均接觸角為113?±3?, 沉積60 s 后平均接觸角為111?±4?. 接觸角越小, 親水性越好, 上述結果證實了ADM 材料的親水性優于PSIS 材料, 進一步證明ADM 層可能更適合細胞附著[8].

圖4 液滴在支架上的沉積瞬間形態Fig.4 Instantaneous morphology of droplet deposition on the support

2.4 降解特性

在1640 培養基(culture medium, CM)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 和人工血漿(AP) 的培養過程中, ADM-PLA-ADM 生物補片支架和對照樣品的降解率基本相同(見圖5). 生物補片支架的降解率略高于PSIS 補片, 這是因為生物補片支架具有較高的比表面積和更多的互相連通的孔隙結構. 30 d 內, PLA 補片的質量沒有明顯變化, 說明PLA 補片的降解性較差. 在前14 d, 生物補片支架在AP 中的降解曲線較為平坦. 而在14～21 d, 生物補片支架在CM、PBS和AP 中的降解趨勢基本相同, 都發生了較大變化, 說明在這一階段生物補片支架外層中的ADM 發生了大量降解, 體現了較好的生物相容性, 有助于在植入前期促進細胞的增殖、長入以及加快組織修復的速度. 在21 d 后, 生物補片支架的降解速率逐漸趨于平穩, 同時后期腹壁組織的再生將伴隨生物補片支架的緩慢降解, 這會保證生物補片支架植入體內后, 在完成組織修復前不會完全降解, 說明其降解率基本滿足現有商用支架性能的要求[13-14].

圖5 各支架在不同溶液中的質量變化曲線Fig.5 Mass change curve of each support in different solutions

2.5 細胞毒性

用CCK-8 進行細胞毒性測定, 實驗結果如圖6 所示. ADM-PLA-ADM 生物補片支架組第1、3、5 d 的吸光度(optical density,OD)值(450 nm 處) 分別為0.984±0.052、2.749±0.213、3.523±0.284. PLA 組第1、3、5 d 的OD 值分別為0.969±0.035、2.589±0.126、3.353±0.285.對照組第1、3、5 d 的OD 值分別為0.942±0.065、2.520±0.292、3.470±0.252. 由實驗數據可以看出, ADM-PLA-ADM 生物補片支架、PLA 支架和對照組樣品在第1、3、5 d 無顯著差異(p>0.05), 說明所制備的支架對細胞無毒. 第3 d 后, 生物補片支架上的細胞存活率逐漸高于PLA 補片組和對照組.

圖6 細胞毒性測試結果Fig.6 Cytotoxicity test results

2.6 動物研究

實驗中, 植入后4 周, 所有大鼠均未出現腸瘺復發等并發癥(見圖7), 對照組(見圖7(a))和多層復合補片組(見圖7(b)) 缺損區域皮下組織修復良好(見圖7(a) 和(b) 中黑色箭頭所指), 未見感染、血清腫、血腫等情況. 腹部表面觀察, ADM-PLA-ADM 生物補片支架修復良好, 覆蓋組織完整(見圖7(c)), 對照組PLA 補片粘連較為嚴重(見圖7(d)), 生物補片支架組粘連較少(見圖7(e)), 平均粘連評分為3.0±1.1. 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE) 染色圖(見圖8) 中, 紅色箭頭所指為PLA 補片, 藍色箭頭所指為周圍炎性組織, 綠色箭頭所指為ADM 材料及其中新生的血管組織. 可以發現生物補片支架的HE 染色結果(見圖8(a)) 顯示其周圍炎性細胞包裹明顯較少, ADM 材料內已經可見新生血管長入. 而對照組PLA 補片的HE 染色結果(見圖8(b)) 顯示其補片周圍炎性包裹較為嚴重, 組織結構紊亂, 未見新生血管.

圖7 補片植入28 d 時的修復情況Fig.7 Repair condition at 28 days after mesh implantation

圖8 HE 染色顯微鏡切片Fig.8 HE staining microscope sections

3 討 論

腹壁重建的組織工程方法往往要求修復支架在植入時必須對細胞和組織有響應, 才能有效、快速地使腹壁缺損愈合. 盡管有多種生物材料和制造技術可用于組織支架的制作, 但器官來源的脫細胞基質因其結構和生物相容性而被認為是一種良好的來源材料, 而3D 打印最近被認為是用于組織工程應用的最先進的支架制造技術之一, 特別是腹壁重建.

本工作利用3D 打印技術, 結合生物源性生物材料(ADM) 和合成源性生物材料(PLA),制備適合組織重建的生物補片支架. 與臨床手術中常用的PSIS 補片和PLA 補片相比, 3D 打印生物補片支架具有更加多樣化的空間結構. 這些結構具有孔隙尺寸多樣、通道結構復雜、機械強度強、生物相容性好等特點, 使得制備出的生物補片支架在臨床組織器官研究中具有很大的潛力. 此外, 3D 打印工藝制備的支架結構尺寸相對均勻, 不僅簡化了制備工藝, 而且可以保證支架的纖維直徑和孔徑. 較多的300～500 μm 孔徑能刺激細胞表現出更好的活性, 實現更好的生長和增殖, 適合組織構建和修復[23].

ADM 具有良好的生物相容性, 已被廣泛應用于支架材料的制備. 此外, ADM 制備的支架在體內外均表現出較高的生物穩定性和小孔隙的特點, 能夠支持細胞的增殖和生長[9]. 利用ADM 粉末, 借助3D 打印技術, 可以制作出具有復雜結構的組織工程支架. 本工作所制備的生物補片支架的顯微鏡圖像顯示了打印纖維的空間結構和粗糙表面(見圖2), 表明所提出的制備方法具備可行性. CCK-8 測量結果表明, 3D 打印ADM-PLA-ADM 生物補片支架在制備過程中沒有產生細胞毒性, 京尼平交聯劑也沒有產生新的細胞毒性.

但目前重建的ADM 層仍存在機械強度較弱等問題. 力學性能在組織工程中起著重要作用, 如果支架在完全降解前具有足夠的機械強度防止疝的發生, 則會顯著降低疝復發率. 因此,本工作采用PLA 補片來提高生物補片支架的機械強度. PLA 補片已廣泛應用于腹壁再生領域, 考慮到PLA 補片在應用過程中可能會發生粘連現象, 可以將其放置在兩個生物相容性好的ADM 層之間, 形成通道結構復雜、力學性能優異的生物補片支架. 通過實驗研究發現, 生物補片支架在補片修復過程中粘連較為輕微, 縫合載荷值為18.05 N(見圖3), 基本可以滿足腹壁修復補片的縫合強度[28]. 應用生物補片支架修復大鼠腹壁缺損模型, 4 周后所有大鼠均未復發, 生物補片支架具有相對穩定的機械強度. 這些結果清楚地表明, 所制備的生物補片支架具有適合組織再生的力學性能.

支架植入后的降解也是組織再生成功的關鍵因素. 如圖5 所示, ADM-PLA-ADM 生物補片支架的降解率略高于PSIS 補片, 這是因為ADM 具有良好的生物活性, 生物降解能力強.雖然ADM-PLA-ADM 生物補片支架降解速率較快, 但其良好的生物活性可幫助細胞在完全降解前進行重建和繁殖. 根據HE 結果(見圖8), ADM-PLA-ADM 生物補片支架植入4 周后腹膜組織完全修復, 腹部表面快速修復導致的粘連較為輕微(見圖7). 同時降解的ADM 支架之間可見大量新生血管和纖維組織, 進一步證明富含血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 等血管因子的ADM 材料可以促進支架內血管生成和組織再生.

4 結束語

本工作利用ADM 和PLA 生物材料, 采用3D 打印技術設計和制造夾層式血管支持補片. 3D 打印ADM-PLA-ADM 生物補片支架的物理和機械性能明顯高于對照組PLA 補片和PSIS 補片. CCK-8 實驗證明了3D 打印生物補片支架無毒. 動物實驗結果表明, 3D 打印ADM-PLA-ADM 生物補片支架具備重建腹壁的能力,且腹壁缺損區域修復良好,無明顯感染、血清腫和血腫. 上述實驗數據表明, 3D 打印ADM-PLA-ADM 生物補片支架可用于腹壁重建.