補骨脂乙素治療潰瘍性結腸炎的分子作用機制

楊 提, 李 珊, 鄧生瓊

(上海市浦東新區公利醫院, 上海 200135)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC) 是一種由免疫調節功能紊亂引發的慢性非特異性腸道炎癥性疾病, 可導致腸道炎癥或潰瘍, 增加結直腸癌風險[1-2]. 目前, 臨床上治療UC 的藥物主要是氨基水楊酸類、糖皮質激素等藥物通過阻礙引起腸道炎癥的免疫炎癥途徑發揮作用,但復發率高、副作用明顯. 隨著臨床上關于中藥治療UC 的研究增多, 中藥治療UC 的優勢逐漸凸顯. 四神丸、寧腸湯和理脾愈瘍湯在治療UC 有一定的療效[3-5], 而補骨脂是上述3 種方劑的君藥, 具有納氣、止瀉、收斂、溫腎、助陽等功效. 補骨脂乙素是一種從補骨脂中提取獲得的天然査爾酮類小分子化合物, 具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性藥理作用[6]. 研究表明, 補骨脂乙素能夠有效降低UC 小鼠結腸炎癥因子水平, 起到抗UC 的作用[7]. 因此, 明確補骨脂乙素抗UC 的確切作用機制是有必要的. 本工作旨在利用網絡藥理學方法結合UC 患者結腸黏膜活檢樣本高通量測序結果以及分子對接技術探索補骨脂乙素干預UC 的潛在靶點,為補骨脂乙素抗UC 的作用機制研究提供新的思路.

1 方 法

1.1 補骨脂乙素靶點獲取

首先, 以“isobavachalcone” 為檢索詞, 通過PubChem 數據庫[8]檢索補骨脂乙素的SMILES (simplified molecular input entry system) 結構; 其次, 根據其SMILES 結構依次導入SwissTargetPrediction 數據庫[9]、PharmMapper 數據庫[10]預測補骨脂乙素的結果作用靶點; 然后, 以isobavachalcone 作為檢索詞于CTD 數據庫[11]獲取補骨脂乙素作用靶點; 最后,將三者結果取并集去重后得到補骨脂乙素所有可能的作用靶點.

1.2 UC 靶點獲取

以“ulcerative colitis”為檢索詞,通過GeneCards 數據庫[12]、DisGeNET 數據庫[13]、OMIM數據庫、DrugBank 數據庫[14]、CTD 數據庫、TTD 數據庫[15]檢索UC 相關治療靶點.

1.3 基于GEO 數據庫的UC 差異表達基因

GSE87466 數據集包含了87 例UC 和21 例健康成人結腸黏膜活檢樣本的轉錄組高通量測序數據, 用4.1.2 版本R 軟件中的limma 包對UC 組和健康對照組進行基因表達差異分析,其差異標準為|log2FC|≥1.5 且P <0.05, 結果以火山圖和熱圖呈現.

1.4 補骨脂乙素干預UC 靶點預測

將獲得的UC 治療靶點與GSE87466 數據集差異基因合并后去重, 得到的UC 治療靶點, 并與補骨脂乙素治療靶點取交集, 繪制交集韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/, venn2.1.0), 交集即為補骨脂乙素可能的抗UC 作用靶點.

1.5 靶點的網絡構建和富集分析

將補骨脂乙素-UC 的共同靶點導入STRING 數據庫(https://string-db.org/, version 11.0), 物種選擇“Homo Sapiens”, 閾值選擇“Medium Confidence”, 進行蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI) 的網絡構建. 將得到的結果導入Cytoscape 3.7.2 軟件中可視化, 根據經驗, 以一級網絡特征參數包含節點的中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、連接度(degree) 的中位數為篩選條件, 篩選出二級網絡圖. 同樣, 以二級網絡特征參數的中位數為篩選條件, 得到三級網絡, 最終篩選出核心靶點. R4.1.2 軟件中clusterProfiler 包對預測靶點進行基因本體(gene ontology, GO) 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 富集分析, 結果以條形圖和氣泡圖可視化.

1.6 分子對接

在Pubchem 數據庫獲取的補骨脂乙素SDF 文件,從PDB 數據庫(https://www.rcsb.org/)獲取核心靶點對應的3D 結構, 利用AutoDockTools 1.5.6 軟件對蛋白加氫、計算電荷等處理后與補骨脂乙素分別進行模擬對接, 記錄對接分數最低構象的結合能, 對接結果利用PyMOL軟件可視化. 對接結果根據自由能判斷結合強度, 小于?5.0 kcal/mol 表示具有較好的結合活性, 小于?7.0 kcal/mol 表示具有強烈的結合活性.

2 結 果

2.1 補骨脂乙素靶點篩選

圖1 為PubChem 中獲取的補骨脂乙素結構. 從SwissTargetPrediction、PharmMapper、CTD數據庫分別獲取了103、291、4 個補骨脂乙素作用靶點, 取并集后去重共得到366 個靶點.

圖1 補骨脂乙素結構Fig.1 Chemical structure of isobavachalcone

2.2 UC 靶點數據庫篩選

從CTD 數據庫中篩選“Inference Score ≥30” 的147 個靶點, 從GeneCards 數據庫獲篩選“Relevance.score ≥5” 的545 個靶點, 從OMIM、TTD、DrugBank 和DisGeNET 數據庫分別獲得2、30、56、308 個靶點, 取并集后共得到1 088 個UC 治療靶點.

2.3 UC 組和健康對照組基因表達差異分析

以P < 0.05 和|lgFC|≥1.5 為臨界值, 從GSE87466 數據集中共篩選出315 個UC 差異基因, 其中196 個為上調基因, 115 個為下調基因. 圖2 為差異基因表達譜的火山圖. 對差異表達處于前25 位的基因繪制熱圖以可視化, 結果如圖3 所示.

圖2 UC 患者和正常結腸組織轉錄組數據差異基因表達譜的火山圖Fig.2 Volcano map of differential gene expression profiles of colonic tissue transcriptome data from UC patients and normal controls

圖3 UC 患者和正常結腸組織轉錄組數據差異基因前25 位基因表達譜熱圖Fig.3 Heatmap of top 25 differential Gene expression profiling of colonic tissue transcriptome data from UC patients and normal controls

2.4 補骨脂乙素干預UC 靶點預測

把UC 組相比健康對照組的差異基因與數據庫預測UC 靶點整合去重后取并集, 得到了1 088 個治療靶點, 再與補骨脂乙素靶點取交集, 共得到107 個補骨脂乙素干預UC 的潛在靶點(見圖4).

圖4 潰瘍性結腸炎和補骨脂乙素靶點交集韋恩圖Fig.4 Venn diagram of UC and isobavachalcone target intersection

2.5 靶點的網絡構建

把107 個靶點導入STRING 數據庫構建PPI 網絡, 下載該網絡的TSV 文件, 共得到107個節點(nodes) 和1171 條邊(edges). 圖5 為蛋白質靶點相互作用網絡圖. 將PPI 網絡TSV文件導入Cytoscape 軟件中可視化, 使用NetworkAnalyzer 工具計算各個節點的網絡特征參數Degree (DC)、BC、CC, 即以DC≥17, BC≥0.003 以及CC≥0.512 為條件, 篩選出二級網絡圖(包含41 個節點和497 條邊). 同樣, 以二級網絡特征參數的中位數為篩選條件, 即以DC≥35、BC≥0.009 以及CC≥0.573 為條件, 得到三級網絡(包含14 個節點和89 條邊). 最終篩選出6 個靶點作為補骨脂乙素-UC 的核心靶點, 結果圖5 和6 所示.

圖5 PPI 網絡Fig.5 PPI network

圖6 核心靶點篩選流程圖Fig.6 Flowchart of core targets screening

2.6 富集分析

對107 個靶點進行富集分析, 結果如圖7 所示. 由圖7 可知: 生物過程(bioprocess, BP)顯著富集于炎癥反應、創傷修復、氧化應激反應、對細菌源性分子的應答及細胞對化學應激的應答過程等; 細胞組分(cellular component, CC) 顯著富集于囊腔、胞質囊腔、分泌顆粒腔、脂筏及膜微區等; 分子功能(molecular function, MF) 顯著富集于絲氨酸內肽酶活性、絲氨酸酶活性、絲氨酸水解酶活性及酪氨酸激酶活性等. KEGG 富集分析顯著富集于脂質與動脈粥樣硬化、P13K-AKT 信號通路、肺癌蛋白多糖、RAS 信號通路等(見圖8).

圖7 GO 富集分析Fig.7 GO enrichment analysis

圖8 KEGG 分析Fig.8 KEGG analysis results

2.7 分子對接

對6 個核心靶點完成模擬分子對接操作后, 發現除PTGS2 以外, 其他靶點與補骨脂乙素均有結合潛力(見表1). 圖9 為核心靶點分子對接結果. 可以看出, 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9, MMP9)、表皮因子生長受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor I,IGFI) 和非受體酪氨酸激酶(SRC) 與補骨脂乙素有良好的結合能力.

表1 6 個核心靶點分子對接結果Table 1 Docking results of 6 core targets

圖9 核心靶點分子對接結果Fig.9 Molecules docking results of core targets

3 討 論

本研究共發現107 個補骨脂乙素干預UC 的潛在治療靶點, 表明補骨脂乙素可能介導多靶點發揮著抗UC 的作用. GO 富集分析可知這些潛在作用靶點主要參與調控炎癥反應、氧化應激應答及細胞對化學應激的應答等, 且很可能發生于囊腔、分泌顆粒腔、脂筏及膜微區等.分子功能主要包括絲氨酸內肽酶活性、絲氨酸酶活性、絲氨酸水解酶活性及酪氨酸激酶活性等. KEGG 富集分析顯著富集于脂質與動脈粥樣硬化、P13K-AKT 信號通路、RAS 信號通路、Rap1 信號通路等. 根據網絡拓撲學參數的中位值, 經過3 輪篩選出了6 個關鍵靶點, 再經過分子對接模擬驗證, 它們與補骨脂乙素均可結合, 其中AKT1、MMP9、EGFR、IGF1 及SRC 有良好的結合能力.

UC 是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD) 的類型之一, 其病因與環境刺激、遺傳、免疫等多個因素有關[16-18], 其中免疫機制的紊亂是機體多種促炎細胞因子與抗炎細胞因子作用失衡的結果[19-20]. 炎性相關細胞因子的調控和釋放與PI3K/AKT 信號傳導通路密切相關[21]. PI3K/AKT 活化后, 可激活核因子kB, 調控免疫炎癥反應相關基因的表達, 如上調炎癥細胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) 等基因的表達, 促進細胞因子的產生和釋放, 誘導細胞因子的失衡, 引發腸道部位的炎癥反應和粘膜損傷, 加劇UC 的進一步惡化[22]. 黃曉麗等[23]通過給予UC 患者結腸粘膜組織PI3K/AKT 信號通路抑制劑干預后,發現結腸組織炎癥反應明顯減輕.AKT 是PI3K-AKT 信號通路的核心因子, 在細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、代謝、蛋白質合成、轉錄等多種細胞活動中起關鍵作用[24-25]. AKT1 作為AKT 家族重要成員之一, 具有促進和維持成肌細胞分化的作用, AKT1 缺失會導致多種組織生長遲緩和細胞凋亡的增加[26-27]. 分析結果表明, AKT1可能作為補骨脂乙素抗UC 的潛在作用靶點, 但仍需進一步實驗驗證. 金屬基質蛋白酶家族(matrix metalloproteinase, MMP) 參與IBD 病變組織的重建和破壞過程. 研究發現, MMP9在UC 患者中持續性高表達且在實驗模型中可通過激活肌球蛋白輕鏈激酶破壞結腸上皮的通透性以及刺激骨髓細胞向病變結腸上皮細胞處募集, 刺激促炎因子TNF 的生成, 誘發炎癥發應[28-29]. 李亞蘭等[30]發現中藥復方葛根芩連湯可通過抑制MMP-9、TNF-α、IL-1β 的表達,阻斷p38-MAPK 信號通路的激活, 增加結腸組織緊密連接蛋白的表達, 從而修復腸道黏膜屏障. EGFR 是原癌基因erbB1 編碼的一種受體酪氨酸激酶, 其配體表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF) 與EGFR 結合后, 啟動p85 基因并激活位于細胞膜附近的p110, 催化細胞膜內表面的PIP2 轉化為PI3P; PI3P 充當第二信使, 促進下游信號通路AKT、GSK3β 及Wnt 等的活化, 促進結腸上皮細胞的生長和增殖[31-33]. SRC 是一種編碼酪氨酸激酶的原癌基因, 參與調節多個生物學過程, 包括細胞增殖、存活、分化、黏附和侵襲等[34]. 研究發現, SRC可通過影響其下游蛋白STAT3 信號通路, 對結腸炎相關癌癥早期的發生、發展起關鍵性作用[35-36]. IGF1 是一種由肝細胞分泌的一種蛋白多肽, 正常狀態下具有促進上皮細胞生長、修復的作用. 在UC 發生過程中, 機體處于炎癥狀態時, IGF1 的表達水平顯著下調, 結腸上皮細胞損傷無法及時修復而進一步加劇UC 的惡化[37]. 炎癥刺激會誘導UC 患者黏膜內間質細胞向纖維原性表型的細胞轉化, 纖維原性表型細胞的活化和持續性增殖導致腸道組織發生纖維化病變[38]. IGF1 參與調控纖維細胞的活化、增殖, 與UC 的發生密切相關[39]. 提示補骨脂乙素可能通過調控IGF1 的表達影響炎癥反應發揮其抗UC 的作用, 具體作用機制需要進一步實驗驗證.

采用網絡藥理學方法聯合GEO 測序數據發現補骨脂乙素干預UC 過程是通過多靶點、多通路來實現的, 分子對接進一步驗證了關鍵靶點與補骨脂乙素結合的可能性, 為補骨脂乙素治療UC 提供了理論基礎. 本工作主要以大數據和生物信息學分析結果為基礎, 后續擬進一步展開細胞及動物實驗, 以期明確補骨脂乙素治療UC 的關鍵作用靶點及信號通路.