基于相似度評價大青龍湯遵古煎煮工藝研究

馬啟風，高紅梅，王炳然，張 淼，陳 晶，唐秋竹，邱智東

（長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

大青龍湯出自張仲景著《傷寒論》[1]，書中記載：“麻黃六兩（去節），桂枝二兩（去皮），甘草二兩（炙），杏仁四十枚（去皮尖），生姜三兩（切），大棗十二枚（擘），石膏如雞子大（碎），上七味，以水九升，先煮麻黃，減二升，去上沫，內諸藥，煮取三升，去滓。”是治療太陽病兼有里證的古方，具有發汗解表、清郁熱、消腫鎮痛、抗病毒的功效，主治外感風寒、兼有里熱。臨床常用于治療哮喘，尤其善于治療小兒哮喘[2-3]、小兒急性支氣管炎、流感、暑熱、急性腎炎、原發性皮膚樣變、嗜睡等病癥[4-6]。《中藥復方制劑生產工藝研究技術指導原則（試行）》[7]明確中藥復方制劑生產工藝研究應遵循“尊重傳統用藥經驗”等基本原則和要求，應最大限度發揮或優于原有方劑的療效。文獻記載大青龍湯的使用方法為水煎服，但煎煮時間尚不明確，無法保證與傳統用藥的一致性。為同時確保大青龍湯煎煮的遵古特性及中藥資源的充分利用，本實驗以古籍記載制備方法建立標準圖譜，對比分析指紋圖譜相似度，優選出與標準圖譜相似度接近且提高飲片利用率的工藝參數。

中藥復方化學成分復雜，其藥理作用具有多靶點、多層次特點，用指標成分含量評價提取工藝不具有整體性，而指紋圖譜技術能全面、定量地反映中藥所包含的已知成分和未知成分的種類和數量[8-10]，其圖譜相似度越接近，煎煮液與原有方劑的組成成分越相同，從而保證復方的有效性和遵古性。出膏率可以反映藥材成分的煎煮程度。熵權法[11-12]是一種根據各指標的分散程度，利用信息熵計算各指標權重的方法，避免人為因素帶來的偏差，評價結果客觀性更強，可以用于需要確定權重的過程。基于此，本研究對比分析指紋圖譜相似度和出膏率，最終確定大青龍湯煎煮工藝參數，為其制劑生產工藝的研究及相關產品的開發與應用提供研究思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030 型高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；AB135-S 型精密十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FA1204B 萬分之一分析天平，上海精密儀器科技有限公司；KQ-250B 型超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；電磁爐，長春恒隆廚房設備有限公司；煎藥壺，潮州壺百飲電器實業有限公司。

1.2 材料

麻黃（批號：20211217），炙甘草（批號：20211108），桂枝（批號：20211218-01），燀苦杏仁（批號：20210812），石膏（批號：20211123），大棗（批號：20211072）均購自吉林省北藥中藥制藥集團有限公司，生姜購于長春中醫藥大學旁邊綜合市場，經長春中醫藥大學翁麗麗教授鑒定，飲片各項標準均符合《中國藥典》2020 版[13]相關規定，炙甘草由本實驗組自行炒制，方法參照2015 版《浙江省中藥炮制規范》[14]：取甘草片，照清炒法炒至表面黃色，微具焦斑時，取出，攤涼。鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201809）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號：171237-201510）均購于中國食品藥品檢定研究所，甲醇，分析純，天津新通精細化工有限公司；乙腈，色譜純，北京化工廠；磷酸，色譜純，北京化工廠；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結果

2.1 處方分析

大青龍湯各飲片劑量為麻黃六兩、桂枝二兩、炙甘草二兩和燀苦杏仁四十枚，生姜三兩，大棗十二枚，石膏如雞子大，量器計量為“升”。《傷寒論》中的藥物劑量“兩”和“g”的換算，參考《中國古代科技史·度量衡卷》[15]，得出東漢1 兩折合為 13.8 g，1 升約為現今200 mL，再結合非標準重量單位計量藥物實物考證，石膏雞子大折算劑量為60 g，杏仁一枚為0.3 g，大棗一枚為2.5 g，得處方一：麻黃82.8 g，桂枝27.6 g，甘草（炙）27.6 g，生姜（切）41.4 g，石膏（碎）60.0 g，杏仁（燀）12.00 g，大棗（擘）30.0 g。參考“十三五”規劃教材《方劑學》以及現今臨床常用劑量，一兩折合為3 g，得處方二：麻黃12.0 g，桂枝6.0 g，甘草（炙）6.0 g，生姜（切）9.0 g，石膏（碎）18.0 g，杏仁（燀）6.0 g，大棗（擘）3.0 g。

2.1.1 供試品溶液的制備 按處方一、處方二稱取各飲片，分別加水1 800 mL，先煮麻黃，減400 mL，去沫，入諸藥，煮取至600 mL，200 目紗布濾過，-18℃凍存12 h 后冷凍干燥72 h，得各處方凍干粉。

分別精密稱取各處方凍干粉0.1 g，置于100 mL具塞錐形瓶，精密加入80% 甲醇30 mL，超聲20 min，放冷后用80%甲醇補足減失重量，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品1.9 mg，置于2 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為0.95 mg·mL-1的混合對照品母液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Platisil 5 μm ODS（4.6 mm× 250 mm），以0.15%磷酸（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫程序：0～10 min，4%～7% B；10～20 min，7%～9% B；20～22 min，9%～9% B；22～32 min，9%～12% B；32～40 min，12%～15% B；40～65 min，15%～35% B；65～80 min，35%～65% B，體積流量1 mL·min-1，柱溫25℃，波長207 nm，進樣體積5 μL。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液5、10、20、40、80、120、160 μL 置入2 mL 量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為2.375、4.75、9.5、19、38、57、76 μg·mL-1系列標準溶液，分別精密吸取系列對照品溶液5 μL 注入液相色譜儀，進行測定。得回歸方程分別為Y= 11 572X+1 518.8，r= 0.999 6，線性范圍2.375～76 μg·mL-1，Y= 9 902.5X+232.9，r= 0.999 7，線性范圍2.375～76 μg·mL-1。結果表明，在相應進樣質量濃度范圍內各成分線性關系良好。

2.1.4.2 精密度考察 取“2.1.1”法制備的處方一供試品溶液，精密吸取5 μL，重復進樣6 次，記錄峰面積，結果樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD 分別為0.22%和0.20%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩定性考察 取“2.1.1”法制備的處方一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”項下方法進行測定，記錄峰面積，結果樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD 分別為1.09%和1.19%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.4.4 重現性考察 平行制備6 份處方一供試品溶液，按照“2.1.3”項下方法測定，計算鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量均值分別為1.02%和0.70%，RSD 為1.12%和1.75%，表明重現性良好。

2.1.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的同一份大青龍湯樣品共6 份，每份約0.1 g，分別加入一定量的對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的平均加樣回收率為98.88%和98.66%，RSD 為1.13%和1.10%（n= 6），表明該方法回收率良好。

2.1.5 劑量考察結果 結合表1，得出不同劑量處方麻黃飲片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總含量相差不大，證明各處方對飲片利用率基本一樣。大青龍湯此次作為防疫方，在針對新型冠狀病毒疫情時，應使用大劑量切中病機，迅速起效，基于此，本實驗選用一兩折合13.8 g。

表1 不同處方劑量考察結果 %

2.2 標準圖譜的建立

供試品溶液的制備 按“2.1.1”項下處方一方法制備供試品。色譜條件，同“2.1.3”色譜條件。標準圖譜，見圖1。

圖1 標準圖譜

2.3 麻黃先煎去沫考察

原文記載為“以水九升，先煮麻黃，減二升，去上沫，再內諸藥”，課題組前期對文獻[16]的考證，發現麻黃是否去沫可能與生物堿類成分關系不大，但于本實驗的成分煎煮是否有影響，是否也不需要。基于此，本研究以麻黃“先煎去沫”理論為切入點，以麻黃先煎去沫圖譜為參照圖譜，采用中位數法，設置時間窗寬度為0.1，得到各圖譜相似度，評價分析麻黃是否需要先煎去沫。圖譜見圖2。

圖2 麻黃去沫指紋圖譜

按處方一稱取飲片，加水1 800 mL，入諸藥，煮取至600 mL，200 目紗布濾過，-18℃凍存12 h后冷凍干燥72 h，即得麻黃未先煎去沫液凍干粉。按“2.1.1”法制備平行樣品。

由圖譜可得麻黃未先煎去沫圖譜與標準圖譜相似度分別達到0.947 和0.930，證明麻黃先煎去沫與否對大青龍湯的成分提取沒有太大影響，且麻黃先煎去沫不適用于實際生產，故本實驗麻黃不用先煎去沫。

3 煎煮工藝研究

3.1 單因素考察

3.1.1 煎煮時間 稱取大青龍湯處方量飲片，在料液比1:6、煎煮1 次的條件下，分別對煎煮時間1 h、2 h、3 h 進行考察。結果見表2，圖譜見圖3。與標準物質比較，隨著時間的延長，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，煎煮2 h 和3 h，出膏率和相似度變化不大，因此煎煮時間選擇1、1.5、2 h 進行正交工藝優化。

圖3 單因素試驗指紋圖譜

表2 大青龍湯提取工藝的單因素試驗結果

3.1.2 料液比 稱取大青龍湯處方量飲片，在煎煮1 h、煎煮1次的條件下，分別對料液比1:6、1:12、1:18進行考察。結果見表2，圖譜見圖3。與標準物質相比，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，料液比為1:12與1:18 時，相似度變化不大，考慮節約溶劑用量，因此料液比選擇1:6，1:8，1:10 倍進行正交工藝優化。

3.1.3 煎煮次數 稱取大青龍湯處方量飲片，在煎煮1 h、料液比1:6 的條件下，分別對煎煮次數1 次、2 次、3 次進行考察。結果見表2，圖譜見圖3。與標準圖譜相比，發現隨煎煮次數增加，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，煎煮3 次時，相似度的結果已不是很高，故將最高煎煮次數確定為3 次，進行正交工藝優化。

3.2 正交試驗設計

在前期單因素試驗結果的基礎上，優化煎煮時間（A）、料液比（B）、煎煮次數（C）三個影響因素，以相似度及出膏率的綜合評分為評價指標，采用 L9（34）正交試驗設計優選最佳煎煮工藝參數，實驗結果見表3，方差分析及結果見表4，圖譜見圖4。

圖4 正交試驗指紋圖譜

表3 大青龍湯提取工藝的正交試驗設計與結果

表4 大青龍湯提取工藝的正交試驗方差分析結果

3.3 熵權計算權重

熵權法[17-18]是對指標體系客觀賦權的方法，其指標的變異程度越小，信息熵就越大，其對應的權值也應該越低，則該指標對綜合評價的影響就越小，反之，該指標影響就越大。經計算得出相似度和出膏率的權重為0.492，0.508。

本研究對正交試驗進行極差和方差分析，結果顯示各考察因素對考察指標影響大小的次序為C ＞A ＞B，根據評分值確定A3B1C2為最佳煎煮工藝，即煎煮2 h、加6 倍量水、煎煮2 次。本研究進一步對正交試驗綜合評分結果進行方差分析，發現正交實驗因素C（煎煮次數）有顯著性差異，因素B（料液比）和因素A（煎煮時間）沒有顯著性差異，即煎煮次數對結果影響最大，料液比和煎煮次數對實驗結果影響不大，考慮實際生產所用時間和資源成本，故減少時間的消耗，確定最佳工藝為用A2B1C2即煎煮1.5 h、料液比1:6、煎煮2 次。

3.4 工藝驗證實驗

稱取大青龍湯全方藥材共281.4 g 3 份，按照上述所得最優大青龍湯煎煮工藝進行驗證試驗，結果見表5，可見3 批樣品綜合評分的RSD 值均在2%以內，說明此煎煮工藝合理、穩定、可行。

表5 大青龍湯的工藝驗證試驗

4 討論

新冠疫情暴發以來，造成了極大的恐慌，也給人們生命安全造成了很大的威脅，而在這次疫情防控中，中醫藥廣泛參與新冠肺炎的治療，深入介入診療全過程，有效發揮了積極作用，助力中國疫情局勢實現逆轉，作為防疫方的大青龍湯為漢代記載方劑，療效確切，應用歷史久遠，但可能存在歷代方義衍變，古今提取容器、提取方式的變化等問題，故為實現傳統制法與現代提取工藝的質量一致性和有效性，應參考古籍，與現代技術相結合來對大青龍湯的提取工藝進行研究。

指紋圖譜是一種綜合、可量化的鑒定手段，可以對中藥復方制劑中多組分、多靶點進行整體評價[19-20]，指紋圖譜大多用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優良性和穩定性，近年來應用于中藥復方的提取工藝。研究[21-23]在評價提取工藝時，不僅考察指標成分含量和出膏率，還包括指紋圖譜相似度，故本研究在遵古的基礎上，與現代技術相結合，考察了處方飲片的現代臨床劑量以及麻黃飲片在煎煮過程中的加入方式，確定處方關鍵信息，得到標準圖譜，建立出膏率和圖譜相似度為主的工藝評價體系，與指標成分含量最大的評價體系相比，本方法不僅兼顧了中藥復方多成分作用特點，還能有效克服在煎煮工藝考察中采用單一評價指標的局限性，最大程度保證尊重傳統用藥的原則，為后續大青龍湯的工業生產提供科學依據。

參考古籍原文記載，本實驗以水為提取溶劑，采用煎煮法進行提取。影響提取工藝的因素為料液比、煎煮次數與煎煮時間，且因素間有交互作用。本實驗在單因素試驗確定各因素水平的基礎上，進一步運用高效率、快速、經濟的正交設計優化大青龍湯現代煎煮工藝參數，所得參數穩定可行。最終確定煎煮工藝參數為煎煮2 次，加6 倍水，煎煮1.5 h。此工藝圖譜與標準圖譜相似度為0.901，出膏率18.3%，可以看出本實驗采取的工藝優化未對大青龍湯應有成分造成破壞，標準圖譜與工藝優化后大青龍湯圖譜基本一致，且煎煮效率有所提升，為其他復方的現代工業化生產提供了參考。