P2X7受體/NLRP3軸對痛風急性發作的調控作用機制研究

劉業洲，李 瑞，白 冰，崔月娜，賀 怡，陳鄔錦，孫玉萍

（新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830000）

急性痛風性關節炎（Acute Gouty Arthritis，AGA）是因為尿酸鈉晶體沉淀引起的一種慢性炎性風濕病[1-2]，近年來發病率逐年增高，并呈現出年輕化趨勢[3-4]。該病病因可能是由于細胞外液尿酸鈉或其結晶沉淀在關節滑膜組織，引起炎癥反應。痛風病人的慢性炎癥會持續很長時間，在急性期會加重，導致組織腫脹，但白細胞、CRP 等感染性指標不會有太大的改變，一般都是通過炎性因素來衡量炎癥的嚴重程度[5]。P2X7 受體是一種雙向功能受體，在受體的第2 跨膜區上，形成一個離子通路[6]；離子的運動與薄膜的電壓有關，參與了炎癥反應的發生與發展。因此，在諸多炎癥性疾病均可檢測到其異常的表達情況能夠促進炎性介質如IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等釋放。研究[7]表明，P2X7 可能激活其下游炎癥相關的通路，通過激活NLRP3復合體，招募ASC和Caspase-1前體，使其成為有活性的Caspase-1（IL-1 轉化酶），持續的ATP 刺激又可使P2X7 受體陽離子通道轉變成非選擇性質膜孔，便于IL-1β 釋放至細胞外發揮炎性作用[8]。本研究基于NLRP3/P2X7 受體軸探討NLRP3與P2X7 受體在痛風中的調節作用機制，以期為后續的藥物研究探尋重要的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

C57 小鼠40 只，9 周齡，體質量23～30 g，雄性，由新疆醫科大學提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2018-0001，倫理批號：S20130418-3。試驗前將小鼠置于（23±2）℃屏障級動物房中飼養1 周，標準飼料，飲用水為自來水。

1.2 藥物與試劑

尿酸鈉鹽，由Sigma（美國）公司制造，戊巴比妥鈉，購于北京源博匯科生物技術研究所。吐溫-80，Sigma（美國）公司，IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒，購于北京欣博盛生物技術有限公司，批號：20191108；NC 薄膜，0.45 μm 孔徑，德國Sartorius 制造；牛血清白蛋白（BSA），購自賽默飛（美國）公司，批號：930342；NLRP3 表達抑制劑Dapansutrile，CAS 號：54863-37-5，購自上海麥克林生化科技有限公司；P2X7 表達抑制劑A-740003，NLRP3 激活劑，貨號：BMS-986299（compound 112），以上購自MedChemexpress 安諾倫（北京）生物科技有限公司。一抗：NLRP3，貨號MA5-32255，稀釋度1:500，ASC，貨號PA5-50915，稀釋度1:500，Caspase-1，貨號14-9832-82，稀釋度1:500，P2X7，貨號PA5-28020，稀釋度1:500，以上均購自賽默飛（美國）公司，IL-1β，貨號ab254360，稀釋度1:500，購自Abcam（美國）公司。

1.3 實驗儀器

3-18K 型，冷凍型高速離心機，德國Sigma 公司生產；全自動酶標分析儀，安圖實驗儀器（鄭州）有限公司；GLP-F300 型，全自動生化分析儀，迪瑞醫療科技股份有限公司，CS-1200 型；電泳槽，孚約生物科技（上海）有限公司 ，通用型；電泳儀，賽默飛生物有限公司。

1.4 模型制作及分組

將單鈉尿酸鹽加入0.9%的氯化鈉注射液，再加入Twin-80（9:1），加1 mL 1.5 moL·L-1NaOH，加熱，攪拌，配制為25 mg·mL-1的尿酸鈉混合液，4℃下貯存，使用前搖勻。采用隨機數表法，將C57 小鼠分成5 組，分別為對照組（0.9%的氯化鈉注射液，8 只）、模型組（8 只）、C 組（小鼠模型鞘內注射P2X7 抑制劑，8只）、D組（小鼠模型鞘內注射NLRP3抑制劑，8只）、E 組（小鼠模型鞘內注射P2X7 抑制劑+NLRP3 激活劑，8 只）。模型制作參照文獻[7]方法造模。使用0.9%氯化鈉注射液（溶解單鈉尿酸鹽）C57 小鼠足部左后外側踝部注射；以0.9%的氯化鈉注射劑作為對照組，每天1 次，連續7 d。造模組關節比健側組皮膚溫度增高、腫脹、骨骼特征消失、腳爪彎曲、四肢無力負重、行走遲緩、后腿彎曲、跛行、三足步態等。

1.5 取材與指標檢測

1.5.1 關節腫脹的測量 在小鼠受試踝關節處做標記，造模后 1、6、12、24、48、72 h 采用爪腫測量儀測量各組小鼠右后踝關節標記以下的容積。關節腫脹度（mL） = （造模后踝關節容積-造模前踝關節容積）。

1.5.2 C57 小鼠炎癥因子及相關蛋白測定 4 周后，用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1體質量）進行腹腔麻醉，用765 g 離心力（離心直徑8.0 cm，15 min），將上部血清吸收，-20℃保存。血清尿酸、尿素氮、肌酐的全自動生化分析儀。用酶聯免疫吸附試驗方法（ELISA法）測定C57 小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量，并嚴格按照ELISA 試劑盒說明進行操作。

1.5.3 蛋白表達 采用蛋白質免疫印跡法檢測關節滑膜組織相關蛋白表達，戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉后，處死小鼠，取腳踝軟骨組織，放在1 個預冷卻的磨盤里，用液氮磨碎直到用 RIVT 分析裂解液來獲取軟骨組織，提取組織蛋白，用BCA 方法測定濃度。按照蛋白:5×Loading Buffer 比例為4:1 混合，在95℃孵育10 min。配制SDS-PAGE 凝膠，按照等體積上樣，100 V 恒壓條件下電泳100 min，此時可觀察藍色水平線進入玻璃板的底部。PVDF 膜經過甲醇活化后，以300 mA 恒流轉膜60 min。5%脫脂奶粉封閉1 h。PVDF 膜放在提前稀釋好的一抗內，在4 ℃過夜反應。PVDF 膜放在二抗內，搖床結合1 h。ECL 發光。加入封閉液稀釋的二抗溶液（稀釋濃度為1:2 000），并在室溫條件下培養60 min。使用PBST 清洗后，使用ECL 發光液顯影，曝光和灰度值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析。計量資料呈正態分布，采用均數±標準差（±s）表示，多組數據比較采用單素方差分析（One-wayANOVA），多組間兩兩比較，采用方差分析；不同時間段比較，采用重復測量的方差分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痛風性關節炎C57 小鼠模型腫脹度與IL-1β、IL-6、TNF-α 表達的情況

與對照組C57 小鼠的踝關節比較，C57 小鼠造模后踝關節的腫脹度顯著升高（P＜0.05），見表1。模型組炎癥因子表達水平高于對照組（P＜0.05），見表2。

表1 2 組AGA 模型C57 小鼠踝關節的腫脹度比較（± s，n= 8）

表1 2 組AGA 模型C57 小鼠踝關節的腫脹度比較（± s，n= 8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

組別6 h24 h48 h72 h對照組 0.12±0.04 0.15±0.03 0.11±0.03 0.12±0.04模型組 0.57±0.06# 0.76±0.14# 0.71±0.09# 0.52±0.06#

表2 2 組AGA 模型C57 小鼠踝炎癥因子表達比較（± s，n= 8）

表2 2 組AGA 模型C57 小鼠踝炎癥因子表達比較（± s，n= 8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組 65.69±22.160.50±0.2315.66±3.83模型組 186.43±63.11#2.87±1.46#20.08±3.01#

2.2 痛風性關節炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達比較

與對照組C57 小鼠的踝關節比較，C57 小鼠造模后NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表達升高（P＜0.05），見表3。

表3 痛風性關節炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達比較（± s，n= 8）

表3 痛風性關節炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達比較（± s，n= 8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

P2X7/β-actin對照組 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型組 1.31±0.07# 1.04±0.08# 1.59±0.09# 3.26±0.14#組別NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

2.3 抑制NLRP3 與P2X7 表達對小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達情況的影響

與模型組比較，抑制NLRP3 的表達，IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3 的表達降低（P＜0.05），P2X7 的表達差異無統計學意義（P＞0.05），與模型組比較，抑制P2X7 的表達，IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 的表達降低（P＜0.05）。見表4，圖1。

圖1 抑制NLRP3 和P2X7 表達對小鼠模型中P2X7、NLRP3 蛋白表達的影響

表4 抑制NLRP3 與P2X7 表達對小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達情況的影響（± s ，n= 8）

表4 抑制NLRP3 與P2X7 表達對小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達情況的影響（± s ，n= 8）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-αP2X7/β-actinNLRP3/β-actin對照組 64.57±23.220.52±0.2214.55±3.890.39±0.090.93±0.05模型組189.99±45.762.99±1.5424.32±3.223.34±0.151.35±0.08 C 組104.69±32.33#1.57±0.32#18.43±3.86#3.39±0.140.37±0.06#D 組136.96±37.37#1.67±0.45#16.49±3.55#2.41±0.09#1.00±0.04#

2.4 NLRP3/P2X7 受體軸對小鼠模型相關基因表達的影響

見表5，表6，圖2。

圖2 NLRP3/P2X7 受體軸對模型動物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達的影響

表5 NLRP3/P2X7 受體軸對模型動物IL-1β、IL-6、TNF-α表達情況比較（± s，n= 8）

表5 NLRP3/P2X7 受體軸對模型動物IL-1β、IL-6、TNF-α表達情況比較（± s，n= 8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

組別 IL-1βIL-6TNF-α對照組 64.57±23.220.52±0.2215.55±3.89模型組 189.99±45.76#2.99±1.54#21.32±3.22#C 組104.69±32.331.57±0.7218.43±3.62 D 組136.96±37.371.57±0.7218.99±3.55 E 組176.96±43.392.87±1.5020.44±3.67

表6 NLRP3/P2X7 受體軸對模型動物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達的影響（± s，n= 8）

表6 NLRP3/P2X7 受體軸對模型動物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達的影響（± s，n= 8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

P2X7/β-actin對照組 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型組 1.31±0.07 1.04±0.08 1.59±0.09 3.26±0.14 C 組0.37±0.06 0.39±0.05 0.44±0.06 3.39±0.45 D 組1.00±0.06 0.64±0.05 0.74±0.07 0.41±0.09 E 組1.07±0.07# 0.92±0.06# 1.23±0.07# 3.30±0.14#組別NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

3 討論

痛風性關節炎是由于患者嘌呤代謝能力較低，血尿酸水平增高，形成尿酸鹽，積存于關節相關軟組織，引起關節部位出現炎癥和病損，多發于中年男性[9]。痛風可以喝一些低脂飲食來降低尿酸值，避免復發。痛風的家族性、基因類型目前的研究還不夠全面[10]，痛風可引起關節囊、滑囊、骨質、軟骨及其他組織的炎癥反應，主要表現為高尿酸血癥、軟組織損傷及反復的關節炎，可分為急性或長期，且易復發，嚴重時會引起關節的腐蝕和損傷，活動障礙合并癥、發病與促進嗜酸性白細胞浸潤、生成促炎細胞因子等因素相關，是一種以炎癥為特點的代謝性自限性疾病，尿鈉通過炎性組織液進入關節軟骨，侵入關節的軟骨，造成骨質疏松，導致損傷是痛風發生的病機與重要因素[11]。近年來，隨著臨床上痛風發病率的急劇增加，該疾病已經引起病患家屬以及全社會的廣泛關注。隨著不同的醫學研究團體的深入研究，痛風的致病機理與調控機制逐步被人們認知。本研究探討痛風發作的分子機制，以期為后續藥物的開發與深度理解疾病的發病機制提供參考。

本研究采用C57 小鼠模型進行研究。模型動物的炎癥因子顯著高于對照組動物，且P2X7 與NLRP3 基因的表達顯著高于對照組（P＜0.05）。本研究與研究[12-13]結果一致，均證實了P2X7 與NLRP3 在痛風相關疾病中的差異表達。本研究在抑制P2X7 表達后的結果證實，小鼠模型的炎癥因子表達顯著降低，即炎癥作用顯著降低，證明P2X7高表達可能是導致痛風炎癥作用的潛在分子機制之一；單獨抑制NLRP3 的表達，得到了與上述研究相類似的結果，綜合以上結果表明，NLRP3 與P2X7的高表達可能是導致模型動物炎癥的重要內在機制，研究[14-17]均支持本研究的結論。并且，本研究結果證實了NLRP3 與P2X7 受體在模型動物中調控作用。本研究將P2X7 的表達抑制，并同時過表達NLRP3表達，進一步證明了P2X7 對下游NLRP3 的調控作用，證明P2X7 是通過NLRP3 進一步發揮小鼠模型中的炎癥作用。

本研究結果證實了P2X7 受體/NLRP3 軸在調控痛風發作小鼠模型中的潛在機制作用，并且與多個相關性研究結果進行對比，進一步證實了本研究結果的可靠性。王敬博[18]研究表明青梅復方對急性痛風性關節炎的干預作用可能是通過NLRP3 發揮作用，邢艷陽[19]證實了NLRP3 與P2X7 在瀉濁解毒通絡法治療急性痛風的作用機制，康佩芝[20]的研究結果表明了P2X7R/NLRP3 信號通道在痛風清熱方對急性痛風性關節炎C57 小鼠局部組織中炎性信號表達的機制作用。以上研究結果均證實了本研究的靶點通路可能在后續的藥物研發和新治療方法中的潛在靶點作用。

綜上所述，本研究證實了P2X7R/NLRP3 信號通道在痛風小鼠模型中的作用機制，為后續的藥物開發與新型治療方法的靶點選擇提供了見解與支持。