lncRNA ENST00000492363在子癇前期患者中的表達及對滋養層細胞的影響

高書芬 蘇 彬 李玉明 胡金朋

子癇前期是女性妊娠期特有的疾病,也是圍生兒及孕產婦發生率與病死率的主要原因之一,其危險因素主要包括子宮胎盤功能障礙、自身免疫性疾病、葡萄胎、營養缺乏等[1]。而子癇前期對胎盤的影響會導致醫源性早產、死產、羊水過少、宮內生長受限等;同時,子癇前期也會造成母體慢性高血壓、缺血性心臟病、肝腎衰竭等,也是導致孕產婦死亡的主要原因,僅次于出血[2]。研究顯示,子癇前期可能與滋養層細胞的侵襲性功能障礙具有相關性[3]。而長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 是位于胞核或胞質中大于200個核苷酸的非編碼RNA,研究顯示,lncRNA與滋養細胞的功能具有重要的相關性[4]。子癇前期患者與正常妊娠患者比較,其胎盤中存在大量的差異性lncRNA,上調的lncRNA大約有15646個,下調的lncRNA大約有13178個,提示子癇前期可能與lncRNA具有相關性[5]。本研究通過前期先進行lncRNA 高通量測序檢測,篩選出兩組患者中lncRNA差異表達最大的為lncRNA,并擬進一步分析該差異lncRNA在滋養層細胞細胞功能中調控的分子機制,從而探討其調控子癇前期的分子機制。

資料與方法

1.實驗材料:選取2018年1～6月收治的子癇前期患者與健康產婦(各15例患者),設為子癇前期組與健康對照組。子癇前期組納入標準:①孕產婦自然受孕且為單胎妊娠;②24h尿蛋白>0.3g或隨機尿蛋白>1+;③妊娠 20 周后收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg;④無蛋白尿,但新發高血壓伴以下任一情況:肝功能損害、腎功能不全、視覺異常或神經系統異常、血小板減少癥、肺水腫。健康對照組納入標準:妊娠過程正常,胎兒發育正常,且無其他合并癥或并發癥。排除標準:①非自然受孕或多胎妊娠;②胎膜早破;③胎兒發育畸形或或羊水過多;④合并其他疾病;⑤胎盤位置或形態異常;⑥產后3個月患者依然高血壓。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會審批通過(倫理學審批號:武人倫2017003)。

每組產婦中各隨機選取9例患者胎盤組織進行高通量測序檢測,篩選出表達差異最大的lncRNA ENST00000492363用于進一步的臨床研究。其他實驗材料還包括JEG-3細胞和HTR-8/Svneo細胞購自中國北納生物科技有限公司;lncRNA ENST00000492363表達載體和空載購自中國中洪博元生物技術有限公司。

2.引物設計即熒光定量PCR檢測:剖宮產取出胎盤樣本后,進行清洗,并在30min內保存保存至-80℃冰箱中。通過數據庫獲得如下基因序列(表1),通用生物系統有限公司合成引物。熒光定量PCR檢測:提取胎盤RNA組織后,利用紫外分光光度儀分別在A260和A280下分別進行計算數據,并計算RNA純度及濃度:RNA濃度=A260×4(ng/μl),RNA純度=A260/280(均在1.8～2.1范圍內)。進行RNA反轉錄后,最后進行熒光定量PCR檢測。

表1 基因序列及退火溫度

3.構建lncRNA ENST00000492363過表達載體:①構建載體:查找基因序列后引入酶切位點(EcoRⅠ:GAATTC;BamHⅠ:GGATCC),合成目的基因片段后連接于pcDNA3.1(+)載體;②質粒轉化DH5α,菌液擴大培養;③去內毒素大提質粒;④質粒酶切驗證;⑤JEG-3細胞和HTR-8細胞傳代;⑥載體轉染:轉染后,將JEG3和HTR-8培養細胞系,各分為3組:過表達ENST00000492363組(ENST00000492363組)、空白表達組(NC組)和正常組(control組)。

4.PCR檢測各組JEG3、HTR-8細胞中ENST00000492363的表達水平:收集培養皿中的細胞,提取RNA后,測定RNA純度及濃度:分別在A280、A260下測定數據,并計算RNA純度、濃度:RNA純度=A260/280(均在1.8～2.1范圍),RNA濃度=A260×4(ng/μl)。最后RNA反轉錄后進行熒光定量PCR。

5.CCK-8檢測各組JEG3、HTR-8細胞增殖水平:把轉染以后JEG3、HTR-8細胞進行孵育后,最后通過酶標儀(450nm波長處)檢測每孔細胞的吸光度值(A)。

6.流式細胞術檢測各組JEG3、HTR-8細胞凋亡水平:各組均分別收集HTR-8、JEG3細胞(1～3)×106個,加入PBS離心后洗2遍,用Binding buffer將細胞重懸,再加入PI-PE以及Annenxin V-FITC,混勻后孵育10min,再加入Binding buffer,混勻后通過流式儀對細胞進行凋亡檢測。

7.劃線實驗檢測各組JEG3、HTR-8細胞的遷移能力:使用10μl槍頭對每孔劃痕,PBS清洗3次后更換為無血清培養基,先對每孔的劃痕拍照,培養箱培養48h后再次進行拍照。分別測量0h及48h的劃痕寬度,計算細胞的遷移速率[(0h劃痕寬度-48h劃痕寬度)/48h]。

8.Transwell實驗檢測各組JEG3、HTR-8細胞侵襲能力:將轉染細胞離心,用培養基將細胞重懸并計數,每個小室細胞數為3×104個;在下室內加入完全培養基,上室細胞與培養基體積共約為300μl;48h后加入結晶紫染液,靜置后擦去內室細胞拍照,最后洗脫后對小室染色水平進行檢測。

9.Western blot法檢測各組JEG3、HTR-8細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平:提取各組細胞的蛋白:加入細胞裂解液放置20min,將細胞刮到一側后吸入EP管內,離心后的上清液中加入緩沖液,沸水煮5min測定各組蛋白濃度:將BSA標準品及待測蛋白樣品分別加入不同管,分別再加入工作液BCA,混勻后孵育30min,通過全自動酶標儀測定標準品BSA及不同樣品的吸光度值,最后計算樣品內蛋白濃度。

10.各組蛋白電泳至曝光:把架子置入電泳液中,拔去齒梳后加入蛋白樣品及marker;加入電泳液浸沒膠板后開始電泳;剪好PVDF膜裁,甲醇激活;切好含有內參或目的條帶的膠;按順序依次將海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿放好,并進行轉膜;使用脫脂牛奶封閉液封閉1h;加入一抗后過夜孵育;洗膜3次后加入二抗,孵育2h;洗膜3次后用發光液浸濕PVDF膜,最后顯影成像。

結 果

1.正常妊娠和臨床子癇前期患者胎盤組織的ENST00000492363表達:與健康對照組比較,子癇前期組的胎盤組織中ENST00000492363的表達顯著降低(P<0.05),詳見圖1。

圖1 PCR檢測胎盤組織中lncRNA ENST00000492363的表達結果

2.滋養層細胞系HTR-8及JEG3中lncRNA ENST00000492363過表達水平:PCR檢測ENST00000492363表達與過表達結果如圖2所示。HTR-8細胞中,Cq(GAPDH)減去Cq(ENST00000492363)平均值為-17.61;JEG3細胞中,Cq(GAPDH)減去Cq(ENST00000492363)平均值為-12.67;因此,JEG3細胞中ENST00000492363的本底表達是HTR-8中的30.69倍。JEG3和HTR-8細胞中ENST00000492363表達載體的表達情況均良好。

圖2 PCR檢測ENST00000492363在JEG3、HTR-8細胞中表達及過表達結果A.ENST00000492363在JEG3細胞中的表達結果;B.ENST00000492363在HTR-8細胞中的表達結果。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

3.ENST00000492363過表達對JEG3或者HTR-8細胞生長的影響:CCK-8檢測結果顯示,ENST00000492363組過表達的細胞增殖水平顯著低于NC組及control組,表明ENST0000049236顯著抑制細胞增殖水平(圖3)。流式細胞術檢測結果顯示,ENST00000492363組過表達的細胞凋亡率顯著高于NC組及control組,表明ENST0000049236促進細胞凋亡(圖4)。

圖3 各組細胞48h增殖水平CCK-8檢測結果A.各組JEG3細胞48h增殖水平CCK-8檢測結果比較;B.各組HTR-8細胞48h增殖水平CCK-8檢測結果比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

圖4 流式細胞術檢測各組JEG3、HTR-8細胞凋亡水平的結果A.各組JEG3細胞凋亡率的比較;B.各組HTR-8細胞凋亡率的比較。與control組比較,*P<0.05

4.JEG3、HTR-8細胞中過表達ENST00000492363對細胞遷移和侵襲的影響:劃線實驗檢測結果顯示,過表達ENST00000492363組的劃線痕跡愈合速度顯著低于NC組及control組,表明過表達ENST00000492363顯著抑制了細胞遷移能力(圖5)。Transwell實驗檢測結果顯示,過表達ENST00000492363顯著抑制了細胞侵襲能力(圖6)。

圖5 劃線實驗檢測各組細胞遷移能力的結果A.JEG3細胞遷移能力比較;B. HTR-8細胞遷移能力比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

圖6 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力的結果A.JEG3細胞A值的比較;B.HTR-8細胞A值的比較。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

5.JEG3或HTR-8細胞中過表達ENST00000492363對E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的影響:Western blot法檢測結果顯示,ENST00000492363過表達可抑制了細胞中Vimentin、N-cadherin的表達,并促進細胞中E-cadherin表達(圖7)。

圖7 Western blot法檢測各組細胞中蛋白質E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的結果A.JEG3細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的比較結果;B.HTR-8細胞中蛋白質E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的比較結果。與control組比較,*P<0.05;與NC組比較,#P<0.05

討 論

子癇前期是妊娠相關的多系統疾病之一,是新生兒、胎兒及孕產婦病死率及發生率的主要原因之一,但其具體機制還不十分清楚[6]。每年子癇前期分別約占圍生兒及孕產婦死亡的10%、15%[7]。研究顯示,胚胎植入早期的滋養層細胞凋亡與增殖保持相對平衡,對子宮動脈重塑具有重要作用,可促進血管擴張、降低血流阻力,從而有利于血流供應并維持正常的侵襲與遷移能力[8]。而子癇前期患者的胎盤出現滋養層細胞凋亡增加、增殖能力減弱及侵襲性降低,最終引起子宮螺旋動脈重塑的異常及胎盤著床淺[9]。因此,滋養層細胞的異常可能與子癇前期患者的發病具有相關性。

近年來研究顯示,lncRNA對滋養層細胞的功能具有直接的影響。PE患者與正常妊娠的胎盤組織內有大量表達差異的lncRNA,表明lncRNA與子癇前期可能具有一定的相關性,如子癇前期患者胎盤RPAIN表達上調后可通過對C1q的調節而促進滋養層細胞凋亡,并抑制其侵襲性,而促進子癇前期的發病[10,11]。而lncRNA PRNCR1表達上調則通過對絲裂原活化蛋白激酶信號通路進行調節,而影響滋養層細胞的功能[12]。lncRNA STOX2-IT3表達表達上調則通過對STOX2的表達調節,而對滋養層細胞的分化于侵襲水平產生抑制作用[13]。lncRNA LINC01410高表達可通過上調Fas表達,而促進滋養細胞的侵襲、增殖[14]。

lncRNA Linc00261高表達會通過抑制miR-558表達,間接抑制其對TIMP金屬肽酶抑制劑4的調控表達,進而降低細胞的遷移、侵襲[15]。lncRNA uc003fir高表達則會與microRNA相互作用,且通過對CCL5直接調節而募集白細胞釋放的促炎細胞因子與單核細胞,進而降低滋養層細胞侵入子宮肌層[16]。lncRNA SNHG5低表達則會減低其對miR-26a-5p/N-鈣黏蛋白信號通路的作用,從而抑制細胞的侵襲、遷移、增殖[17]。lncRNA TUG1低表達則會影響MMP2、MCL1、VEGFA的表達,并通過抑制RND3與促進Ezh2表達而抑制螺旋動脈重塑,促進滋養層細胞凋亡,而減低細胞的侵襲、遷移、增殖[18]。

本研究通過發現子癇前期患者的臨床胎盤組織內ENST00000492363表達低于正常胎盤組織,滋養層細胞系JEG3和HTR-8被用于進一步研究。PCR檢測結果表明,ENST00000492363在HTR-8細胞中的本底明顯低于JEG3細胞。而ENST00000492363過表達后,HTR-8 與JEG3細胞凋亡率顯著上升、且細胞增殖抑制,細胞的侵襲及遷移能力均顯著下降。另外有研究顯示,上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對滋養層細胞的分化、轉移具有關鍵性的作用。本研究通過對HTR-8 與JEG3細胞內的EMT的標志性基因Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白質的表達檢測,結果顯示滋養層細胞系HTR-8、JEG3中ENST00000492363過表達,會顯著上調蛋白質E-cadherin的表達,并抑制蛋白質Vimentin、N-cadherin的表達,表明ENST00000492363對滋養層細胞EMT具有顯著的抑制作用,這也進一步驗證了ENST00000492363對滋養層細胞侵襲、遷移能力的抑制作用。

本研究中ENST00000492363對滋養層細胞增殖的抑制作用及凋亡的促進作用,可能與ENST00000492363對CASP10基因表達的促進作用相關,進而導致蛋白質caspase-10表達上升,促進細胞凋亡上升,這也可能是細胞中EMT被抑制的原因之一。

綜上所述,基因CASP10表達的lncRNA ENST00000492363對滋養層細胞有顯著的調控作用,會顯著抑制滋養層細胞的侵襲及遷移能力,并抑制上皮-間充質的轉化過程,同時可顯著抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。