安神定志方對阿爾茨海默病細胞模型miR-103a-3p及Tau蛋白磷酸化的影響

王欣波 ，齊明明 ，邵音 ，趙宇 ，聶雙蓮 ，樸勇洙

1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種病因尚不明確的中樞神經系統退行性疾病，臨床以認知功能降低與進行性記憶力減退為主要表現。作為臨床癡呆的常見誘因，AD以異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神經原纖維纏結和含β淀粉樣蛋白（Aβ）的老年斑塊為主要病理特征，目前尚無特效療法能阻止或逆轉AD 進展[1]，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[2-3]。目前全球約有5 000萬AD患者，預計到21世紀中葉罹患AD的人數將升至1.52億，我國目前約有1 000萬AD患者。

miRNA是一類核苷酸內源性非編碼RNA，具有高保守性和組織特異性，通過Aβ代謝、氧化應激反應、神經炎癥、Tau蛋白磷酸化和膽固醇代謝等生理過程參與AD發生發展[4]。課題組前期研究發現，安神定志方能抑制海馬組織miR-103a-3p/BDNF通路，參與Tau蛋白磷酸化的調控，發揮改善AD大鼠學習記憶能力的作用[5]。本研究通過體外實驗觀察安神定志方對Aβ誘導的大鼠PC12 細胞miR-103a-3p/BDNF/TrkB 通路相關分子表達的影響，進一步闡明安神定志方治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

清潔級雄性SD大鼠20只，8周齡，體質量（200±5）g，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物許可證號SCXK（黑）2015-003。飼養于黑龍江中醫藥大學中西醫結合實驗室動物房，溫度22.5～24.5 ℃，相對濕度44%～53%，光照時間12 h/d，自由攝食飲水。大鼠PC12細胞株購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 藥物及制備

安神定志方（黨參15 g，茯神15 g，茯苓15 g，龍齒25 g，石菖蒲5 g，遠志5 g），飲片購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房。將飲片置于圓底燒瓶中，加清水浸泡，文火煎煮2次后合并藥液，過濾后將藥液濃縮至原藥材濃度為1 g/mL，即得安神定志方水煎劑。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ25-35（貨號A4559），美國Sigma公司；胎牛血清（貨號10099141C）、DMEM 培養基（貨號11965084），美國Thermo Fisher 公司；MTT（貨號C0009S）、Annexin V-FITC 試劑盒（貨號C1062S）、Tau 抗體（貨號AF1249）、p-TauSer396抗體（貨號AF2368）、腦源性神經營養因子（BDNF）抗體（貨號AF1423）、HRP標記二抗（貨號A0208）、Lipo6000轉染試劑（貨號C0526），上海碧云天；酪氨酸激酶受體B（TrkB）抗體（貨號ab187041）、p-TrkB抗體（貨號ab229908）、β-actin 抗體（貨號ab6276），英國Abcam公司；miR-103a-3p模擬劑，上海艾博思生物科技有限公司合成；TaqMan miRNA反轉錄試劑盒（貨號4366596）、定量檢測試劑盒（貨號4427975），美國ABI公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（貨號E-BCK046-M）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號E-BCK025-S），武漢伊萊瑞特；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號MM-0386R2），江蘇酶免；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（貨號A005-1-1），南京建成。倒置相差顯微鏡（型號XZ-10），廣州明美光電技術有限公司；流式細胞儀（型號Attune NxT）、實時熒光定量PCR儀（型號ABI7500），美國Thermo Fisher公司；電泳儀（型號164-5052）、凝膠成像儀（型號GelDoc），美國伯樂公司；全自動多功能酶標儀（型號DP-9602G），北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.4 含藥血清制備

20只大鼠隨機分為空白組和安神定志方組，每組10只。按人與動物等效劑量換算給藥劑量，安神定志方組予安神定志方水煎劑8 g/kg灌胃，空白組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續7 d。末次灌胃24 h后，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，水浴滅活，0.22 μm濾膜過濾，即得空白血清和含藥血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 分組、造模及干預

PC12細胞以DMEM完全培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞穩定傳代2～3代后進行實驗。

取對數期PC12細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，轉染前更換為Opti-MEM 減血清培養基，通過Lipo6000 將miR-103a-3p 模擬劑轉染至50%融合的PC12細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，6 h后更換為DMEM完全培養基繼續培養24 h，收集細胞進行后續實驗。

設置空白組、模型組、安神定志方組、過表達組和安神定志方+過表達組（聯合組），每組3個復孔。PC12細胞以106個/孔接種于6孔板，過表達組和聯合組接種轉染miR-103a-3p模擬劑的細胞。除空白組不予處理外，其余各組采用20 μmol/L Aβ25-35處理24 h建立AD細胞模型[6]。24 h后，空白組、模型組和過表達組更換為10%空白血清培養基，安神定志方組和聯合組更換為10%含藥血清培養基，置培養箱中繼續培養。

1.6 指標檢測

1.6.1 細胞活力

培養24、48、72 h 向各孔加入5 mg/mL MTT 溶液，繼續孵育4 h，酶標儀波長570 nm處檢測各孔吸光度，即為細胞活力。

1.6.2 細胞凋亡

培養48 h 后收集細胞，1 000 r/min 離心10 min，按106個/mL進行重懸，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL，暗室孵育15 min，通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡水平，計算凋亡率。

1.6.3 氧化應激相關指標檢測

培養48 h 后收集細胞上清液，參照試劑盒說明書檢測上清液LDH 活性。細胞經反復凍融進行裂解，3 500 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA 法進行蛋白定量，參照試劑盒說明書檢測MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.6.4 RT-qPCR檢測

培養48 h后收集細胞，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒合成cDNA，TaqMan miRNA定量試劑盒進行RT-qPCR。反應條件：95 °C、60 s；95 °C、15 s，60° C、15 s，72 °C、45 s，4 °C、1 min，共40個循環。以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-103a-3p相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot檢測

培養48 h后收集細胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，4 ℃、1 000 r/min離心10 min，采用BCA法測定蛋白濃度。上樣20 μg，SDS-PAGE 分離蛋白，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入BDNF一抗（1∶1 000）、p-TrkB一抗（1∶1 000）、TrkB一抗（1∶5 000）、p-Tau一抗（1∶500）、Tau一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加HRP標記二抗（1∶1 000），37 ℃孵育40 min。采用ECL法對膜進行顯影，凝膠成像系統成像后使用Quantity One 3.0軟件分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 安神定志方對PC12細胞活力的影響

空白組細胞形態正常，呈多角形或梭形，細胞貼壁成簇生長，突起較長且相互交織呈網狀分布；模型組細胞縮小變圓，呈脫壁聚集狀，部分細胞漂浮、折光性下降，突起變短甚至消失；安神定志方組及聯合組細胞在細胞生長與交織成網方面與模型組接近，在細胞數量方面較模型組減少、突起較模型組縮短、連接較模型組紊亂；過表達組PC12細胞損傷嚴重，細胞皺縮聚集、折光性驟降、突起減少。見圖1。

圖1 各組PC12細胞形態（×100）

與空白組比較，模型組PC12細胞各時點細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯合組PC12細胞各時點細胞活力明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），過表達組各時點細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與過表達組比較，聯合組PC12細胞各時點細胞活力明顯升高（P＜0.01）。安神定志方組培養48 h時細胞活力升高最明顯，因此選擇培養48 h進行后續實驗。見表2。

表2 各組PC12細胞不同時點細胞活力比較（±s）

表2 各組PC12細胞不同時點細胞活力比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達組比較，●●P＜0.01

組別空白組模型組安神定志方組過表達組聯合組72 h 0.69±0.06 0.41±0.03**0.51±0.04##0.34±0.04##0.46±0.06#●●n33333 24 h 0.45±0.03 0.31±0.04**0.41±0.04##0.25±0.03##0.37±0.03#●●48 h 0.57±0.04 0.36±0.05**0.52±0.07##0.28±0.03##0.43±0.03#●●

2.2 安神定志方對PC12細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯合組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），過表達組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與過表達組比較，聯合組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見表3、圖2。

圖2 各組PC12細胞凋亡檢測流式圖

表3 各組PC12細胞凋亡率比較（±s，%）

表3 各組PC12細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達組比較，●●P＜0.01

凋亡率10.39±1.17 22.85±1.97**12.67±1.19##30.82±2.31##17.48±1.23#●●組別空白組模型組安神定志方組過表達組聯合組n33333

2.3 安神定志方對PC12細胞氧化應激相關指標的影響

與空白組比較，模型組細胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯合組細胞LDH活性和MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性增加，過表達組細胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與過表達組比較，聯合組細胞LDH 活性和MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組PC12細胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）

表4 各組PC12細胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與過表達組比較，●●P＜0.01

GSH-Px/（μmol/L）26.45±1.73 8.58±1.12**15.12±2.36##4.13±0.89##10.34±1.29#●●組別空白組模型組安神定志方組過表達組聯合組n33333 LDH/（U/L）346.12±25.12 832.98±41.19**391.45±24.78##943.48±42.23##687.26±36.57##●●SOD/（U/mL）198.47±14.36 48.32± 4.01**173.21±16.12##22.15± 3.89##64.36± 4.71#●●MDA/（mmol/mL）265.24±19.12 587.18±31.13**276.35±19.89##734.67±32.18##513.61±29.27#●●

2.4 安神定志方對PC12 細胞miR-103a-3p mRNA 表達的影響

與空白組比較，模型組細胞miR-103a-3p mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯合組細胞miR-103a-3p mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），過表達組miR-103a-3p mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與過表達組比較，聯合組細胞miR-103a-3p mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。見表5。

表5 各組PC12細胞miR-103a-3p mRNA表達比較（±s，相對表達量）

表5 各組PC12細胞miR-103a-3p mRNA表達比較（±s，相對表達量）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與過表達組比較，●●P＜0.01

miR-103a-3p 1.00±0.03 2.92±0.19**1.78±0.12##3.91±0.21##2.13±0.14##●●組別空白組模型組安神定志方組過表達組聯合組n33333

2.5 安神定志方對PC12 細胞Tau、腦源性神經因子、酪氨酸激酶受體B蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組PC12細胞p-Tau蛋白表達明顯升高，BDNF、p-TrkB蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，安神定志方組和聯合組PC12細胞p-Tau蛋白表達明顯降低，BDNF、p-TrkB蛋白表達明顯升高，過表達組PC12細胞p-Tau蛋白表達明顯升高，BDNF、p-TrkB蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與過表達組比較，聯合組PC12 細胞p-Tau 蛋白表達明顯降低，BDNF、p-TrkB蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組細胞Tau、TrkB蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表6。

圖3 各組PC12細胞Tau、BDNF、TrkB蛋白免疫印跡

表6 各組PC12細胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表達比較（±s）

表6 各組PC12細胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與過表達組比較，●●P＜0.01

TrkB 0.84±0.06 0.82±0.05 0.83±0.03 0.82±0.07 0.81±0.06組別空白組模型組安神定志方組過表達組聯合組n33333 p-Tau 0.11±0.02 0.49±0.05**0.18±0.03##0.73±0.09##0.31±0.04##●●Tau 0.98±0.09 1.04±0.12 1.01±0.09 1.05±0.11 1.03±0.11 BDNF 1.07±0.10 0.51±0.15**1.03±0.09##0.39±0.06##0.62±0.13##●●p-TrkB 0.94±0.11 0.37±0.06**0.61±0.07##0.21±0.03##0.51±0.08##●●

3 討論

AD屬中醫學“癡呆”范疇，為本虛標實之證，以虛為主，日久導致臟腑衰憊，或每與痰瘀兼雜，治療上應重視痰瘀與AD的關系[7]。安神定志方出自《醫學心悟》，具有安神益智、豁痰開竅功效。方中黨參與遠志安神益智，為君藥；臣以茯苓、茯神健脾寧心安神；佐以石菖蒲、龍齒豁痰開竅、鎮驚安神。研究發現，本方藥物及其有效成分可通過多靶點、多通路發揮治療AD作用[8-10]。本研究結果表明，安神定志方可以改善Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷，提高細胞活力，抑制其凋亡水平。

氧化應激反應在AD生理病理過程中扮演重要角色，可加劇神經元損害，并通過誘導神經元細胞周期紊亂，導致神經退行性病變，進而引起患者認知能力改變。MDA作為脂質過氧化的最終產物，可抵抗活性氧（ROS）誘導的氧化應激，可以間接提示細胞過氧化損傷程度。過度的氧化應激引起ROS大量釋放，從而增加MDA含量，進一步導致神經鞘膜完整性破壞。有研究顯示，機體氧化應激損傷程度與LDH活性呈正相關，而氧化應激能導致細胞膜損傷，增加細胞膜通透性，促使LDH釋放到細胞外[11]。SOD能減輕氧化應激對神經元造成的損傷，在不飽和脂質氧化降解過程中，SOD能夠抑制ROS誘導的MDA產生，抑制神經毒性[12]。研究發現，機體內GSH-Px等抗氧化酶減少可導致體內自由基大量生成，加強過氧化反應，破壞組織和細胞，降低組織功能，造成機體衰老[13]。本研究結果發現，安神定志方可顯著降低PC12細胞LDH活性和MDA含量，增加SOD和GSH-Px活性，表明安神定志方可抑制Aβ25-35誘導的氧化應激反應。

BDNF是廣泛分布于大腦皮層和海馬組織的堿性蛋白，通過調控神經元突觸形態與功能影響學習能力。作為神經保護因子，BDNF對神經元生長、分化、成熟和可塑性的維持具有重要作用[13]。此外，BDNF可通過與細胞膜上TrkB蛋白特異性結合，調控神經遞質的合成及釋放[14-15]。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，主要分布于神經元的軸突部分，其磷酸化水平與腦組織神經原纖維的纏結程度密切相關。Aβ通過與Tau蛋白結合形成可溶性的穩定復合物，進一步促進神經原纖維纏結及突觸功能障礙，從而誘導神經元細胞死亡[16]。Tau蛋白異常磷酸化是AD的特征性病理表現，在眾多的Tau蛋白磷酸化位點中，以絲氨酸（占53%）與蘇氨酸（占41%）位點磷酸化為主[17]。據報道，Thr231、Thr181和Ser396位點與AD密切相關[18-19]。本研究結果表明，安神定志方可顯著下調PC12細胞miR-103a-3p mRNA 表達，與動物實驗結果[5]一致。在此基礎上，Western blot結果證實，安神定志方能顯著上調BDNF和p-TrkB蛋白表達，而miR-103a-3p模擬劑能顯著下調PC12細胞BDNF及p-TrkB蛋白水平。此外，本實驗結果還發現，miR-103a-3p模擬劑能上調Ser396位點p-Tau蛋白表達，而安神定志方能部分拮抗miR-103a-3p對Tau蛋白磷酸化的促進作用。

綜上所述，安神定志方可能通過抑制PC12細胞miR-103a-3p表達激活BDNF/TrkB信號通路，從而抑制Tau蛋白磷酸化，對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷發揮保護作用。