冠心病痰瘀互結證小型豬血漿代謝組學研究

張國瑗，李磊，孟紅旭，王奧奧，王紫艷，胡廣，李瑛，馬彥雷，史躍，孫明謙，劉建勛

中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱“冠心病”），是多種危險因素所致的心臟疾病，由冠狀動脈血管發生粥樣硬化而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死。冠心病屬中醫學“胸痹”“真心痛”范疇，其病機為本虛標實，痰瘀互結證是冠心病的基本證型之一[1]。

疾病發展常伴隨某些代謝障礙，代謝組學可以對疾病誘導產生的代謝產物變化進行分析，為中醫證型診斷的現代化發展提供基礎和方向。豬的心血管系統在解剖和病理機制等方面與人類相似，其實驗結果有利于推用到人，被認為是制備心血管疾病動物模型的合適動物[2]。而小型豬冠狀動脈系統與人類接近，本課題組在小型豬體內建立冠心病痰瘀互結證模型，該模型既符合該病臨床發病特點，又滿足中醫學強調胸痹心痛的發病要求[3]。

人體血漿含有多種內源性小分子代謝物，不同類別代謝物性質復雜，增加了血漿樣品分析難度。磷脂是細胞膜的主要成分，存在于血液等生物基質樣品中，因磷脂會與目標分析物共洗脫并離子化，引起質譜信號的離子抑制，導致其他類成分檢測效率較低，故樣品前處理過程對實驗結果會產生重要影響。本研究采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜（UPLCQTOF-MS）技術和非靶向代謝組學方法，通過有機試劑沉淀蛋白與固相萃取（SPE）去除磷脂相結合的方法對冠心病痰瘀互結證小型豬血漿除磷脂外的代謝物進行代謝組學特征分析，探究冠心病痰瘀互結證小型豬血漿內源性代謝物的變化。

1 材料與方法

1.1 動物

中國實驗小型豬12只，雌雄各半，體質量15～20 kg，北京北七家美樂養殖場提供，動物生產許可證號SCXK（京）2018-0004。動物飼養、實驗操作均在中國中醫科學院西苑醫院實驗動物中心進行，動物使用許可證號SYXK（京）2018-0018。本研究經中國中醫科學院西苑醫院動物實驗倫理委員會審查批準（2021XLC037）。高脂飼料[4]（每100 kg含膽固醇2 kg、膽鹽0.5 kg、豬油10 kg），北京科澳協力飼料有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC 液相色譜系統、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質譜儀、MassLynxV4.1色譜工作站（美國Waters公司），3-18K型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），VORTEX GENIUS 3型渦旋振蕩器（德國IKA公司），Milli-Q gradient A-10純水儀（美國Millipore公司），96孔SPE裝置（美國Waters公司），Ostro 96孔SPE板（美國Waters公司）。乙腈、甲酸為色譜純，美國Fisher Scientific公司；蘇木素染液（珠海貝索生物技術有限公司，貨號C201207），伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，貨號C200401）。

1.3 分組與造模

將小型豬隨機分為對照組和模型組，每組6只。采用高脂飼料喂養結合冠狀動脈血管內皮損傷法建立冠心病痰瘀互結證小型豬模型：模型組以高脂飼料喂養（每只900 g/d）2周后，參照文獻[4]采用介入法行冠狀動脈血管內皮損傷術，術后繼續予高脂飼料（劑量同前）喂養8周。對照組僅冠狀動脈造影，不進行介入損傷術，并予普通飼料喂養（每只900 g/d）。

1.4 取材

造模結束后，動物禁食14 h，鎖骨下靜脈采血 3 mL，置肝素鈉抗凝管中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 組織病理學觀察

取心臟梗死區/非梗死區交界處心肌組織，置4%多聚甲醛溶液中固定，行HE和Masson染色后，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態變化。

1.6 樣本處理

室溫解凍血漿樣本，充分混勻后取50 μL，加入96孔SPE板中，加入乙腈-甲醇（1∶1）混合液200 μL，劇烈振搖1 min，通過正壓裝置在板上施加約15 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力，使樣品均勻流出至樣品接受盤中，直至完全排干，所接樣品溶液待測。

1.7 色譜及質譜條件

色譜條件：采用Waters BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫40 ℃，樣品室溫度4 ℃，流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，30%B；1～10 min，30%～90%B；10～11 min，90%B；11～13 min，90%～30%B；13～15 min，30%B），流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），信號采集分別采用正、負離子掃描模式，碰撞氣為高純氬，離子源溫度100 ℃，去溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流量50 L/h，溶劑氣流量800 L/h。正離子模式下毛細管電壓+3 kV，負離子模式下毛細管電壓-2.5 kV。采用全信息串聯質譜（MSE）模式進行centroid數據采集，一級掃描范圍m/z 50～1 200 Da，采集所有碎片信息，掃描時間0.2 s。采用甲酸鈉標準品建立質量軸標準曲線。數據采集過程中，每3 s用Lockspray校正系統進行亮氨酸-腦啡肽（[M+H]+556.277 1、[M-H]+554.261 5）實時質量校正。

1.8 數據處理

對收集的MSE數據采用Progenesis QI軟件處理，進行峰對齊、峰提取、峰鑒定等操作，使用HMDB（http://www.hmdb.ca/）對二級碎片特征進行比對并驗證，獲得代謝物信息，包括質荷比、保留時間和峰面積等。將信息導入MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）并初步識別組間差異，通過模型參數Q2（模型的可預測性）和R2（模型的擬合性）評估模型質量。將數據導入EZinfo 2.0，篩選第一主成分變量重要性投影（VIP）＞1的代謝物。以VIP＞1、差異倍數（FC）＞2且t檢驗P＜0.05 為條件篩選潛在差異代謝物。通過MetaboAnalyst 5.0結合KEGG（https://www.kegg.jp/）、HMDB數據庫對篩選出的差異代謝物進行代謝通路分析，找出差異代謝物涉及的代謝通路。

2 結果

2.1 模型豬心肌組織病理變化

HE染色顯示，對照組心肌組織、心肌細胞形態及結構正常，分布均勻且緊密，心肌纖維排列較整齊、橫紋清晰，未見纖維斷裂或變形；模型組心肌細胞肥大、排列紊亂，部分心肌細胞核增大、融合，心肌間質水腫，裂隙明顯增寬且雜亂，心肌纖維排列無序，部分纖維斷裂，肌纖維束增寬。見圖1。

圖1 2組小型豬心肌組織形態（HE染色，標尺=100 μm）

Masson染色顯示，對照組心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色，細胞間無明顯膠原纖維沉積，心肌細胞排列整齊、結構清晰；模型組心肌細胞及間質大量膠原纖維增生，心肌細胞排列扭曲，細胞腫脹、結構模糊。見圖2。

圖2 2組小型豬心肌組織形態（Masson染色，標尺=100 μm）

2.2 血清代謝物分析

使用Progenesis QI軟件對2組數據進行峰提取和匹配，正離子模式下共識別出8 585個化合物，負離子模式下共識別出3 417個化合物。正、負離子模式下所得總離子流圖見本文OSID碼。

2.3 模式識別分析

將處理后的代謝物信息導入MetaboAnalyst 5.0，通過PLS-DA進行有監督的數據分析，得到對照組與模型組PLS-DA得分見圖3、圖4。

圖3 2組小型豬血漿代謝物PLS-DA得分

圖4 2組小型豬血漿代謝物三維PLS-DA得分

PLS-DA結果顯示，正離子模式下，2組有明顯分離趨勢，R2=0.998，Q2=0.681；負離子模式下，模型組與對照組有明顯區別，R2=0.994，Q2=0.856。在PLS-DA得分圖（見圖3）中，橫坐標表示組間差異，縱坐標表示組內差異，對照組與模型組分離趨勢明顯，表明模型動物血漿代謝物發生明顯改變。在相同模式下，對照組組內差異較模型組組內差異大，而模型組組內差異不明顯，原因可能是去除磷脂后對照組比模型組受到的影響更為明顯。

2.4 差異代謝物篩選

通過HMDB數據庫確定代謝物結構，以VIP＞1、FC＞2、P＜0.05為條件篩選潛在差異代謝物，正離子模式下篩選出9個代謝物，負離子模式下篩選出18個代謝物，差異代謝物主要為膽酸類、脂肪酸類、氨基酸類、酰基肉堿類等（見表1）。膽酸類包括初級膽汁酸[7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸（7a,12a-dihydroxy-3-oxo-4-cholenoic acid）、3b,12a-二羥基-5a-膽酸（3b,12adihydroxy-5a-cholanoic acid）]和次級膽汁酸[（脫氧膽酸甘氨酸結合物（deoxycholic acid glycine conjugate）、別石膽酸（allolithocholic acid）]；脂肪酸類包括十六烷二酸（hexadecanedioic acid）、3-氧代十八烷酸（3-oxooctadecanoic acid）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）等；酰基肉堿類包括丁烯肉堿（butenylcarnitine）、3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿（3-hydroxy-9-hexadecenoylcarnitine）、3-羥基十六烷基肉堿（3-hydroxyhex-adecanoylcarnitine）、(9E)-10-硝基十八烷-9- 烯酰肉堿（(9E) -10-nitrooctadec-9-enoylcarnitine）等。

表1 2組小型豬血漿潛在差異代謝物

2.5 差異代謝物相關代謝通路分析

將26個潛在差異代謝物通過MetaboAnalyst 5.0結合KEGG和HMDB數據庫進行代謝通路分析。結果顯示，多條代謝通路受到影響，主要包括肉堿穿梭代謝、內源性大麻素代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、亞油酸代謝、脂肪酸代謝、膽堿代謝、丙酮酸代謝、苯乙胺代謝等。

3 討論

本研究采用高脂飼料喂養結合冠狀動脈血管內皮損傷法建立冠心病痰瘀互結證小型豬模型，分析模型組與對照組血漿差異代謝物情況。

高分辨質譜精準度受基質效應的干擾，對血液樣品而言，主要受磷脂類物質的干擾[5]，因此，樣本處理方法采用SPE去除磷脂。有機溶劑如乙腈、甲醇用于解離生物體液樣品，去除蛋白質，該方法并不會去除磷脂[6]。前期研究表明，高脂飼料造模后，小型豬血漿中磷脂類成分含量較高，這類成分會對其他成分產生離子抑制，導致檢測成分種類相對較少，無法對冠心病痰瘀互結證的代謝途徑進行全面分析[7]。同時，磷脂類成分可以采用專門的脂質組學方法進行深入研究，代謝組學方法很難系統地對小型豬脂質組變化進行闡釋[8]。本研究樣品處理方法同時去除生物樣品中的蛋白和磷脂，著重觀察除磷脂以外的代謝物，可以降低小分子液相-質譜分析受到的干擾，從而較為全面地分析非磷脂類差異代謝物的變化。研究結果顯示，模型組血漿內源性小分子代謝物發生了變化：在正離子模式下，模型組與對照組3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿、3-羥基十六烷基肉堿、2-花生四烯基甘油醚、α-亞麻酰乙醇酰胺、白三烯A4、20-COOH-白三烯E4、7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、N-肉豆蔻酰賴氨酸、吡啶啉含量有顯著差異；在負離子模式下，7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、丁烯肉堿、脫氧膽酸甘氨酸結合物、牛磺熊去氧膽酸、石膽酸甘氨酸結合物、甘膽酸、二十二碳六烯酸、L-乳酸、苯乙胺葡糖苷酸等含量有顯著差異。

本研究發現，模型組血漿7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、脫氧膽酸甘氨酸結合物、3b,12a-二羥基-5a-膽酸、12-酮脫氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、1β-羥基膽酸、石膽酸甘氨酸結合物、甘膽酸、別石膽酸含量升高，提示膽汁酸代謝增加。膽汁酸的生理作用是促進食物內脂類的消化和吸收[9]，膽汁酸的生物合成是內源性膽固醇的主要代謝去路，其形成是一個復雜的過程。初級膽汁酸（膽酸和鵝去氧膽酸）由膽固醇在肝細胞內產生，并以牛磺酸和甘氨酸結合物的形式隨膽汁排出，再通過膽進入腸道。這些初級膽汁酸被腸道微生物去共軛、去羧基、脫氫、差向異構，形成次級膽汁酸（脫氧膽酸和石膽酸）。本研究中模型組血漿膽酸含量整體上升，提示冠心病痰瘀互結證小型豬體內脂質代謝異常。7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、3b,12a-二羥基-5a-膽酸這2種豬膽酸含量升高，有利于對體內代謝異常進行調節。脫氧膽酸甘氨酸結合物、12-酮脫氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、石膽酸甘氨酸結合物、別石膽酸5個次級膽酸含量升高，可能因為膽汁酸的重吸收障礙導致血漿中膽酸含量增加，從而引起繼發性損害。Chen等[10]研究顯示，12-酮脫氧膽酸、牛磺酸脫氧膽酸、二十二碳六烯酸可作為腎臟損傷的標志物。石膽酸的酸毒性強，可引起肝膽系統障礙，Yang等[11]研究顯示，石膽酸能促使肝內膽汁淤積，引起肝損傷。

本研究發現，模型組血漿酰基肉堿類成分含量發生較明顯變化，其中4個為長鏈酰基肉堿類成分。肉堿在線粒體脂肪代謝中起重要作用，酰基肉堿作為肉堿代謝的中間產物，是一類由肉堿與脂肪酸結合而成的結構相似的代謝物。在各種組織和體液中廣泛分布，能反映早期脂肪酸氧化失衡和線粒體應激狀況。其生物功能是將長鏈脂肪酸從細胞質轉移到線粒體基質中進行β氧化。一些代謝性疾病也以產生和排出異常濃度的酰基肉堿為特征。有研究表明，因線粒體脂質過載、大量脂肪酸不完全氧化而導致線粒體應激，可能是造成體內糖脂代謝異常的原因之一[12-14]。本研究中模型組血漿長鏈酰基肉堿含量明顯增加，可能由于小型豬經高脂飼料喂養后，體內脂質代謝紊亂，脂肪酸氧化代謝受到干擾，進一步加劇體內氧化應激損傷，從而導致疾病加重。

本研究還發現，十六烷二酸、3-氧代十八烷酸、二十二碳六烯酸3個成分含量出現異常，進一步提示該模型脂肪酸代謝異常。肉堿代謝紊亂導致體內脂肪酸代謝途徑受阻，因此脂肪酸類成分含量也升高。20-COOH-白三烯E4為白三烯E4的脂質氧化代謝物，屬于花生四烯酸類成分。白三烯E4是一種半胱氨酰白三烯，為強效炎癥介質，可通過其受體與G蛋白和細胞內信號通路偶聯，促進炎癥反應。這類成分含量升高提示模型小型豬體內炎癥反應增強，可能與其脂質代謝紊亂、氧化應激壓力不斷增加、冠狀動脈內皮拉傷有關。

目前采用代謝組學進行冠心病痰瘀互結證生物信息學分析的報道相對較少，本研究基于液相色譜-質譜聯用技術，采用有機溶劑沉淀蛋白和SPE相結合的樣品處理方法，對冠心病痰瘀互結證小型豬血漿除磷脂外的代謝物進行代謝組學特征分析，篩選出7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、3b,12a-二羥基-5a-膽酸、脫氧膽酸甘氨酸結合物、別石膽酸、十六烷二酸、3-氧代十八烷酸、二十二碳六烯酸、丁烯肉堿、3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿、3-羥基十六烷基肉堿、(9E)-10-硝基十八烷-9-烯酰肉堿等26個差異代謝物，涉及肉堿穿梭代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、膽堿代謝、丙酮酸代謝等途徑。本研究對冠心病痰瘀互結證發病機制進行一定程度的闡釋，今后將繼續進行更深層次研究，為臨床治療提供更多依據。