超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和地西泮的含量

◎ 朱欣欣，崔倩倩，劉 琳，劉 璐，周瑩瑩，賈松濤，付燕峰，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450001；3.鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

孔雀石綠應(yīng)用在水產(chǎn)品中是一種很好的抗菌劑，能提高水產(chǎn)品的存活率，因此孔雀石綠被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)品中[1]。1992 年，孔雀石綠被國際癌癥研究機構(gòu)列為二類致癌物。人體長期食用后，容易在體內(nèi)富集，引起身體內(nèi)臟、眼睛、血液、脾、皮膚等器官和身體組織慢性中毒[2]。

地西泮屬于二類精神類藥物，人體長期攝入后，可能會出現(xiàn)嗜睡疲乏、動作失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重者還可能出現(xiàn)心律失常、昏迷、精神錯亂等情況[3]。若孕婦及哺乳期婦女使用，會增加致畸風(fēng)險，新生兒會呈現(xiàn)撤藥癥狀以及肌張力低下等。《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235 號》中將地西泮規(guī)定為“允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出的藥物”[4]。本文主要研究了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和地西泮的含量。

1 材料與方法

1.1 樣品

淡水魚，絞碎并均質(zhì)，-18 ℃保存。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

甲醇（色譜級）；乙腈（色譜級）；甲酸（色譜級）；正己烷；孔雀石綠（批號1125838，純度93.2%，美國DR）；孔雀石綠D5（批號G1062742，純度81.47%，美國DR）；地西泮（批號FE12021903，純度100%，SIGMA-ALDRICH）。

1.3 儀器與設(shè)備

TSQ vanquish 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧（ESI）離子源；天平：感量為0.01 g；水浴鍋；振蕩器；離心機；超聲波；0.22 μm微孔有機相濾膜。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg·L-1）。避光稱取10 mg 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（2）孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg·L-1）。避光稱取10 mg 孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（3）地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg·L-1）。避光稱取10 mg 地西泮標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（4）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng·mL-1）。避光下分別吸取100 μL 孔雀石綠和地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（5）孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng·mL-1）。避光下吸取100 μL 孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

1.4.2 測定步驟

（1）提取。避光稱取樣品2.0 g（精確到0.01 g）于50 mL 棕色離心管中，加入孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)工作液40 μL，渦旋混勻1 min，加入20 mL 1%甲酸乙腈進(jìn)行提取，8 000 r·min-1勻漿提取10 min，超聲提取5 min，8 000 r·min-1離心5 min，上清液全部取出轉(zhuǎn)移至另一個離心管中，20 mL 1%甲酸乙腈加入殘渣離心管中重復(fù)上述步驟進(jìn)行提取，提取完后合并兩次上清液，45 ℃水浴鍋氮氣吹至近干，加入1 mL乙腈定容，旋渦混合，待凈化（樣品在前處理過程中，應(yīng)避免強光直射[5]）。

（2）凈化。待凈化液加入5 mL 正己烷進(jìn)行除脂，渦旋混合1 min，靜待分層，吸取下層液，過0.22 μm濾膜至棕色進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：MG Ⅱ C18（2.0 mm×150 mm，3 μm）；流動相：水（A）+0.1%甲酸甲醇（B）；梯度洗脫：0 ～1 min，80%A+20%B；1.0 ～3.5 min，5%A+95%B，3.5 ～5.0 min，80%A+20%B； 流速：0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI）、正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（SRM）方式。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng·mL-1）0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 和10.00 mL 于50 mL棕色容量瓶中，向其分別加入2 mL孔雀石綠-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng·mL-1），用1%甲酸乙腈定容，配制成濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的孔雀石綠和地西泮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，孔雀石綠-D5 濃度為4 ng·mL-1，臨用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果

在質(zhì)譜條件下對孔雀石綠、孔雀石綠-D5 以及地西泮的母離子及子離子進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1，離子對色譜圖見圖1、圖2 和圖3。

圖1 孔雀石綠離子對色譜圖

圖2 孔雀石綠-D5 離子對色譜圖

圖3 地西泮離子對色譜圖

表1 待測物定性離子對、定量離子對、碰撞能量、錐孔電壓的優(yōu)化結(jié)果表

2.2 線性方程

由表2 可知，孔雀石綠、地西泮在0.5 ～20.0 ng·mL-1有良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 0。方法的檢測低限為0.5 ng·mL-1。

表2 孔雀石綠和地西泮的線性方程和相關(guān)系數(shù)表

2.3 回收率以及精密度實驗

在淡水魚中添加孔雀石綠-D5 標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)控濃度溶液分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1，進(jìn)行平行實驗，計算加標(biāo)回收率和精密度。由表3可知，樣品回收率在82.1%～96.1%，精密度在2.9%～7.8%。

表3 樣品的精密度和加標(biāo)回收率結(jié)果表

2.4 實際樣品檢測

采用本方法對多個地市抽取的水產(chǎn)品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示孔雀石綠和地西泮均有檢出，且回收率較高，說明市場上水產(chǎn)品中仍含有一定量的孔雀石綠和地西泮，存在食品安全隱患。

3 結(jié)論

本研究建立了一種 HPLC-MS/MS 同時測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和地西泮的方法。結(jié)果表明，采用該法測定的結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于實驗室日常檢測。