響應面法優化苗藥艷山姜總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

魏晴 張俊 盧虹志 薛娟 梁珊珊

摘 要： 結合單因素試驗和響應面法優化艷山姜總黃酮的超聲提取工藝，同時研究艷山姜總黃酮的抗氧化活性。以提取時間、超聲功率、液料比、乙醇濃度和超聲溫度為單因素進行考查，在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken模型對提取參數進行優化，獲得最佳提取條件。此外，以Vc為對照，運用DPPH自由基和ABTS自由基來評價艷山姜總黃酮的抗氧化活性。結果表明，艷山姜總黃酮超聲提取的最佳提取工藝條件為：提取時間26 min，超聲功率60 W，液料比25∶ 1（mL/g），超聲溫度60 ℃，乙醇濃度70%。在此條件下， 艷山姜總黃酮提取液對DPPH自由基和ABTS自由基有較強的清除作用， 隨著總黃酮濃度的升高，其抗氧化能力逐漸增強， 其IC50分別為0.41 mg/mL和0.49 mg/mL。該工藝穩定可行，可為艷山姜總黃酮的開發利用提供研究基礎。

關鍵詞： 響應面法；艷山姜；總黃酮；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）03－0006－07

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.03.002

艷山姜始見于《植物名實圖考》，廣泛分布在我國西南地區［1-2］。艷山姜具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧的功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀，已被收錄于2003版《貴州省中藥、民族藥標準》［3-4］。艷山姜主要含有揮發油、黃酮等成分，目前對于揮發油的提取和藥理作用研究比較深入，對其他成分研究較少［5-8］。

研究表明，艷山姜中黃酮含量較高，但對于總黃酮的提取及其活性研究較少［9］。目前對于小分子有機物的提取方法一般為回流提取法，該方法提取時間長，次數多，還需使用流動的水以降低冷凝管的溫度，比較浪費水資源，而超聲波可以產生空化的現象，有助于細胞壁的破裂、固體材料孔徑的減小以及增加接觸表面的固相和溶劑之間的區域，有利于有效成分的提取［10-11］。響應面方法（RSM） 是一種有效的數學和統計工具，廣泛用于評估各種試驗過程中的多個參數及其變量之間可能的相互作用，其優點是減少了試驗次數，節約了能源、時間和原材料 ［12-13］。

因此，本試驗以艷山姜總黃酮為研究對象，采用超聲提取法，優化艷山姜總黃酮最佳提取工藝，進一步采用DPPH和ABTS法探究艷山姜總黃酮抗氧化活性，為艷山姜總黃酮類成分的開發和利用提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

艷山姜藥材購自華夏藥業有限責任公司，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜 ?Alpinia zerumbet ?（Pers.）Burtt.et Smith的干燥根。

蘆丁標準品（純度>98％，貴州迪大科技有限公司批號：C100001）；95%乙醇（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；維生素C（Vc）（國藥集團化學試劑有限公司）；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 ?儀器與設備

UV759紫外可見分光光度計（上海佑科儀器設備有限公司）；DKS-16恒溫水浴鍋（嘉興市中新醫療儀器有限公司）；FA1004電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；JP040S超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設備有限公司）。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?艷山姜總黃酮提取的單因素試驗

提取時間對艷山姜總黃酮含量的影響：固定超聲功率、液料比、乙醇濃度和超聲溫度，改變提取時間，按照表1分別對艷山姜進行提取，考察不同提取時間對艷山姜總黃酮含量的影響。

超聲功率對艷山姜總黃酮含量的影響：固定提取時間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度，改變超聲功率，按照表2分別對艷山姜進行提取，考察不同超聲功率對艷山姜總黃酮含量的影響。

液料比對艷山姜總黃酮含量的影響：固定提取時間、超聲功率、乙醇濃度和超聲溫度，改變液料比，按照表3分別對艷山姜粉末進行提取，考察不同液料比對艷山姜總黃酮含量的影響。

乙醇濃度對艷山姜總黃酮含量的影響：固定提取時間、超聲功率、液料比和超聲溫度，改變乙醇濃度，按照表4分別對艷山姜進行提取，考察不同乙醇濃度對艷山姜總黃酮含量的影響。

超聲溫度對艷山姜總黃酮含量的影響：固定提取時間、超聲功率、液料比和乙醇濃度，改變超聲溫度，按照表5分別對艷山姜進行提取，考察不同超聲溫度對艷山姜總黃酮含量的影響。

1.3.2 ?艷山姜總黃酮含量的測定

參考羅愛琴等[14]的方法繪制黃酮標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=2.276X-0.0058， R2 =0.9997。總黃酮含量（%）=C×D×V×100/（m×1000）；式中：C為樣品中總黃酮濃度；D為樣品溶液稀釋倍數；V表示供試品溶液體積；m為樣品的質量。

1.3.3 ?響應面分析法試驗設計

根據單因素試驗結果，選取對總黃酮含量影響較大的四個因素：提取時間（A）、超聲功率（B）、液料比（C）、超聲溫度（D）為自變量，本試驗采用四因素三水平Box-Behnken響應面法進行試驗設計，因素與水平見表6。

1.3.4 ?抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除活性的測定：參考李倩茹等［16］的方法，配制不同濃度（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL）艷山姜總黃酮提取液；以Vc作為陽性對照，每個樣品平行測定3次，取平均值，計算半數抑制濃度IC50。

ABTS自由基清除活性的測定：參考Hui等［17］方法，以Vc作為陽性對照，每個樣品平行測定3次，取平均值，計算半數抑制濃度IC50。

1.4 ?數據處理

使用Design-Expert 10.0.1和GraphPad Prism 8.0.1軟件進行數據處理和分析，抗氧化試驗重復3次，數據均以“平均值±標準偏差”表示。

2 ?結果與討論

2.1 ?單因素試驗結果

2.1.1 ?提取時間對艷山姜總黃酮含量的影響

由圖1可知，艷山姜總黃酮含量隨提取時間的變化，呈先增長后降低的趨勢，當提取時間為30 min 時總黃酮含量達到最高。30 min后總黃酮含量降低，其含量下降的原因可能是隨著提取時間的增加，會破壞黃酮類化合物的結構，使黃酮含量下降；另一個原因可能是隨著提取時間的增長，艷山姜細胞中其它成分也被提取出來，使黃酮的溶出受到抑制，從而使總黃酮含量降低。因此提取時間需要在25～35 min之間進行進一步優化。

2.1.2 ?超聲功率對艷山姜總黃酮含量的影響

由圖2可知，艷山姜總黃酮含量隨超聲功率的變化，呈先增長后降低的趨勢。當超聲功率為60 W 時，艷山姜總黃酮含量達到最高。當超聲功率大于60 W后艷山姜總黃酮含量顯著下降，下降的原因可能是隨著超聲功率的增大，對黃酮的結構有一定破壞，使得總黃酮含量降低。因此超聲功率需要在40～80 W之間進行進一步優化。

2.1.3 ?液料比對艷山姜總黃酮含量的影響

由圖3可知，艷山姜總黃酮含量隨液料比的變化，呈先增長后降低的趨勢。當液料比為30∶ 1時，艷山姜總黃酮含量達到最高。當液料比超過30∶ 1后艷山姜總黃酮含量降低。下降的原因可能是隨著液料比的增加，可能會引入大量雜質，使艷山姜中非黃酮類雜質被提取出來，故總黃酮含量下降。因此，液料比在20∶ 1～40∶ 1之間進行進一步優化。

2.1.4 ?乙醇濃度對艷山姜總黃酮含量的影響

由圖4可知，總黃酮含量隨乙醇濃度的變化，呈先增長后平穩不變的趨勢。當乙醇濃度為70 %時艷山姜總黃酮含量達到最高。當乙醇濃度超過70%，艷山姜總黃酮含量基本保持不變。由于乙醇濃度在70%后艷山姜總黃酮含量幾乎不變，從經濟成本角度考慮，將乙醇濃度固定為70%。

2.1.5 ?超聲溫度對艷山姜總黃酮含量的影響

由圖5可知，總黃酮含量隨超聲溫度的增加，呈先增長后降低的趨勢。當超聲溫度在60 ℃時，艷山姜總黃酮含量達到最高。超過60 ℃后艷山姜總黃酮含量顯著下降，可能的原因是隨著溫度升高，易促進黃酮的氧化，同時增加雜質的溶出，使得總黃酮含量降低。故超聲溫度需要在50～70 ℃之間進一步優化。

2.2 ?響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以提取時間、超聲功率、液料比、超聲溫度為自變量，總黃酮含量為響應值，設計四因素三水平的響應面分析，采用 Box-Behnken 中心組合設計進行響應面優化試驗，運用 Design-Expert 10.0.1 軟件對試驗數據進行統計分析，結果見表7。

采用Design-Expert 10.0.1軟件分析得到二次多項回歸方程為：總黃酮含量（%）=1.36 -0.007333A+0.015B-0.011C+0.013D-0.013AB+ 0.0040AC+0.00775AD+0.00175BC-0.021BD- 0.00575CD-0.068A2-0.075B2-0.10C2-0.066D2。 對響應面模型進行方差分析及顯著性檢驗，其結果見表8。

由表8可知，該模型差異具有統計學意義（ P <0.0001）， R 2Adj（矯正系數）為0.9979， R2 （預測復相關系數）為0.9889， R2 ?Pred（預測相關系數）為0.9405，矯正系數與預測復相關系數差值小于0.2，說明偏差在合理范圍內，實際值和預測值擬合度比較好。失擬項不顯著（ P =0.0964>0.05），說明選擇的模型對該試驗的擬合度較好。變異系數 為0.79%， 說明該模型相關性好，可用該擬合回歸方程對不同條件下艷山姜總黃酮的最佳含量進行分析。

由表8可知，B、C、D、BD、A2、B2、C2、D2的P值<0.01，A和AB的 P 值<0.05，以上因素對總黃酮含量的影響顯著，其他因素對總黃酮含量的影響不顯著。由 P 值可知，4個因素對艷山姜總黃酮含量的影響程度的大小順序為：超聲功率＞超聲溫度>液料比>提取時間。

采用Design-Expert 10.0.1軟件做超聲提取工藝參數的Box-Behnken響應面3D圖及等高線分析圖，見圖6，通過其擬合圖形分析各因素對艷山姜總黃酮含量的影響。結合表8的 P 值和圖6可知，B和D對響應面弧面影響較大，且等高線的橢圓率更高。通過求解回歸模型方程得到最佳超聲提取工藝參數為：提取時間25.91 min、超聲功率為59.36 W， 液料比為24.97∶ 1，超聲溫度為59.23 ℃， 乙醇濃度70%，總黃酮含量為1.281%。

注：a.提取時間和超聲功率的三維圖面; b.提取時間和超聲功率的等高線圖; c.提取時間和液料比的三維圖面; d.提取時間和液料比的等高線圖; e.提取時間和超聲溫度的三維圖面; f.提取時間和超聲溫度的等高線圖; g.超聲功率和液料比的三維圖面; h.超聲功率和液料比的等高線圖; i.超聲功率和超聲溫度的三維圖面;j.超聲功率和超聲溫度的等高線圖; k.液料比和超聲溫度的三維圖面; l.液料比和超聲溫度的等高線圖。

2.3 ?工藝條件優化與驗證

為檢驗試驗結果的可靠性，按照優化后的工藝參數進行3次平行試驗，同時考慮到實際操作的可行性，最終將試驗參數定為： 提取時間26 min、超聲功率為60 W、液料比25∶ 1 （mL/g）、超聲溫度60 ℃ 、乙醇濃度70%，得到的總黃酮含量平均值為1.291%，與預測值1.281%的相對偏差為0.77%，說明本試驗所建模型預測性較好且穩定。

2.4 ?艷山姜總黃酮抗氧化活性測定

2.4.1 ?對DPPH自由基清除能力

由圖7可知，隨著艷山姜總黃酮含量的增加，對DPPH自由基的清除能力呈現先增強后平穩不變的趨勢。艷山姜總黃酮與陽性對照Vc的IC50值分別為0.41 mg/mL、0.19 mg/mL。

2.4.2 ?對ABTS自由基清除能力

由圖8可知，隨著艷山姜總黃酮含量的增加，對ABTS自由基的清除能力呈現先增強后平穩不變的趨勢。艷山姜總黃酮與陽性對照Vc的IC50值分別為0.49 mg/mL、0.20 mg/mL。

3 ?結論與討論

本文在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化了艷山姜總黃酮的超聲提取工藝。結果表明，在提取時間26 min，超聲功率60 W，液料比25∶ 1（mL/g），超聲溫度60 ℃，乙醇濃度70%的條件下，艷山姜總黃酮含量為1.291%。與傳統回流提取法相比，超聲提艷山姜總黃酮提取時間更短，效率更高。進一步通過DPPH和ABTS體外抗氧化活性研究表明，艷山姜總黃酮對DPPH和ABTS自由基有一定的清除能力，且在一定范圍內，清除能力與黃酮的濃度呈正相關關系。

（責任編輯：嚴秀芳）

參 考 文 獻：

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith by Response Surface Methodology

Wei Qing1，2，3，Zhang Jun1，Lu Hongzhi1，Xue Juan1，2，3，Liang Shanshan1，2，3*

（1.School of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025，China；2.Research Center of Cinnamomum migao H.W.Li，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025，China；3.Plant Polysaccharide Research Center，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

Combined with single factor experiment and response surface methodology，the ultrasonic extraction process of total flavonoids from Miao medicine， Alpinia zerumbet ?was optimized.At the same time，the scavenging ability of DPPH free radical and ABTS free radical was used as evaluation indexes to study the antioxidant activity of total flavonoids from ?A.zerumbet ?in vitro.Taking extraction time，ultrasonic power，ratio of liquid to material，ethanol concentration and ultrasonic temperature as single factors，on the basis of single factor experiment，Box-Behnken model was used to optimize the extraction parameters and obtain the best conditions.In addition，compared with Vc，DPPH free radical and ABTS free radical were used to evaluate the antioxidant activity of total flavonoids from ?A.zerumbet .The outcomes demonstrated that Alpinia zerumbet's total flavonoids could be extracted most effectively using ultrasonic technology.The extraction time 26 min，ultrasonic power 60 W，ratio of liquid to material 25∶ 1 （mL/g），ultrasonic temperature 60℃，ethanol concentration 70%.Under this condition，the extract of total flavonoids from ?A.zerumbet ?had a strong scavenging effect on DPPH free radical and ABTS free radical.With the increase of total flavonoids concentration，its antioxidant capacity gradually increased，and its IC50 was 0.41 mg/mL and 0.49 mg/mL respectively.The process was stable and feasible，which could serve as a guide for the production and use of total flavonoids in Alpinia.

Keywords：

Alpinia zerumbet ; total flavonoids; response surface methodology; antioxidant activity