基于生物信息學構建肝細胞癌預后相關circRNA-miRNA-mRNA調控網絡

袁浩桐，姜博文，李真鵬，井媛旭，袁碩，楊超

（齊齊哈爾醫學院 1.口腔醫學院；2.醫學技術學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其病死率位居惡性腫瘤第3位［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝癌類型，約占肝癌的90%［2］。手術切除和肝移植是肝癌患者的根治性療法，但術后轉移及復發風險高，預后極差［3］。因此，深入探究肝癌發病機制，積極尋找肝癌早期分子標志物，對提高肝癌的預后有重要意義。

環狀RNA（circle RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，首尾相接形成閉合的圓環，不易被RNA酶降解，被認為是有潛力的生物標志物［4］。circRNA可通過競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）機制，影響肝癌的發生和發展。HUANG等［5］發現circRNA_104348可通過吸附miR-187-3p，上調靶基因RTKN2的表達，促進肝癌細胞的增殖和遷移。但circRNA在肝癌中的研究仍處于初級階段，有待進一步探討［6］。

本研究基于基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫中下載的數據集GSE97332和GSE164803，篩選出肝癌相關差異表達circRNA，并構建肝癌預后相關ceRNA調控網絡，為深入挖掘肝癌發生的分子機制，尋找肝癌潛在的circRNA診斷標志物提供一定的研究依據。

1 材料與方法

1.1 HCC芯片數據的收集

HCC相關circRNA表達譜數據下載自GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.gov/geo/）。數據集GSE97332包括7例HCC樣本和7例肝正常組織樣本，芯片平臺為GPL19978；GSE164803包括6例HCC樣本和6例肝正常組織樣本，芯片平臺同為GPL19978。

1.2 HCC相關差異表達circRNA的篩選

采用GEO2R在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），以校正后的P<0.05、|log2FC|>2為標準，篩選數據集GSE97332及GSE164803中的差異表達circRNA，交集分析得到共差異表達circRNA。

1.3 預測與circRNA相結合的微RNA（microRNA，miRNA）

分別在Circular RNA Interactome（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）與circBank（http：//www.circbank.cn）數據庫中預測與共差異表達circRNA相結合的miRNA，所得結果取交集作為后續研究的miRNA。

1.4 構建circRNA-miRNA-mRNA網絡

分別在miRDB（http：//mirdb.org/）、RNAInter（https：//www.rna-society.org/rnainter/）、Targetscan（http：//www.targetscan.org/）數據庫中預測miRNA的下游靶基因mRNA。交集分析確定miRNA最終調控基因。依據ceRNA理論構建circRNA-miRNA-mRNA網絡，并用Cytoscape3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/）將網絡可視化展示。

1.5 靶基因功能富集分析和通路富集分析

利 用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對篩選出的靶基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，富集標準為P<0.01，基因數>10。

1.6 構建靶基因蛋白質-蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction networks，PPI）并篩選核心基因

在STRING數據庫（https：//string-db.org/）中查詢靶基因的蛋白質互作信息，以PPI combined score>0.4為閾值條件，在Cytoscape3.7.2軟件中構建PPI網絡，應用CytoHubba插件中的Degree算法，選擇前10 位基因作為核心基因。

1.7 核心基因生存分析

應用基于基因表達水平值的交互式分析平臺（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）對核心靶基因進行生存分析，腫瘤類型選擇“liver hepatocellular carcinoma，LIHC”，檢測核心基因的表達對肝癌患者總生存率的影響，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選HCC差異表達circRNA

應用GEO2R對HCC相關circRNA數據集進行差異表達circRNA篩選，以校正后P<0.05，|log2FC|>2為標準，從GSE97332中得到147個差異表達的circRNA，其中，上調97個，下調50個（圖1A）；從GSE164803中得到67個差異表達的circRNA，其中，上調22個，下調45個（圖1B），將2組數據取交集僅得到1個共差異表達circRNA：hsa_circRNA_0000301，將其作為后續研究對象。

圖1 GSE97332與GSE164803差異表達circRNA火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed circRNAs in GSE97332 and GSE164803

2.2 構建HCC相關circRNA-miRNA-mRNA調控網絡

采用生物信息學軟件Circular RNA Interactome及circBank來預測與hsa_circRNA_0000301結合的miRNA，結果顯示，通過Circular RNA Interactome 得到8個與hsa_circRNA_0000301互作的miRNA，通過circBank得到26個與hsa_circRNA_0000301互作的miRNA（表1），交集分析得到4個miRNA，即hsa-miR-377-3p、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-1178-3p及hsamiR-1228-3p。

表1 生物信息學預測與hsa_circRNA_0000301相結合的miRNATab.1 Bioinformatics prediction of miRNAs associated with hsa_circRNA_0000301

采用miRDB、RNAInter、TargetScan數據庫預測上述4個miRNA的靶基因，交集分析確定miRNA最終調控基因。結果顯示，hsa-miR-377-3p的靶基因有296個，hsa-miR-767-3p的靶基因有260個，hsa-miR-1178-3p的靶基因有154個，hsa-miR-1228-3p的靶基因有144個（圖2）。將4個miRNA的靶基因匯總去重后，最終得到813個靶基因。采用Cytoscape軟件構建肝癌相關circRNA-miRNA-mRNA調控網絡圖。網絡中包含1個circRNA節點、4個miRNA節點、813個mRNA節點和858條邊。

圖2 應用miRDB、RNAInter、TargetScan數據庫預測miRNA的靶基因Fig.2 Target genes of miRNAs were predicted using miRDB，RNAInter，and TargetScan databases

2.3 靶基因功能富集分析

應用DAVID數據庫對與813個靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析結果顯示，有15個生物學過程存在富集，主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程、細胞對缺氧的反應等；10個細胞組分存在富集，主要有突觸后膜、雙細胞的緊密連接、核內體等；13個分子功能存在富集，主要有蛋白激酶結合、序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區域序列特異性DNA結合等（圖3）。KEGG分析結果顯示，hsa_circRNA_0000301在6個通路中富集，包括與肝癌發生密切相關的MAPK信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路等（圖4）。

圖3 GO功能富集結果Fig.3 Gene ontology enrichment analysis results

圖4 KEGG通路富集分析結果Fig.4 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.4 篩選核心靶基因

在STRING數據庫中查詢813個靶基因的蛋白質互作關系，構建PPI網絡，應用Cytoscape中的CytoHubba插件，篩選出的10個核心基因為EGFR、STAT3、SMAD2、HIF1A、MTOR、EIF4E、NR3C1、PRKACB、NRAS、CHD4。

2.5 核心靶基因生存分析

應用GEPIA數據庫查詢核心基因與肝癌患者預后的關系，結果顯示，EIF4E、PRKACB、NRAS這3個基因高表達患者的總生存率均明顯低于低表達患者，差異有統計學意義（P<0.05），其他7個基因對肝癌患者總生存率的影響不顯著（圖5）。

圖5 核心基因生存分析曲線Fig.5 Survival analysis curves of core genes

2.6 構建HCC預后相關circRNA-miRNA-核心靶基因調控網絡

在cytoscape軟件中構建HCC預后相關circRNAmiRNA-核心靶基因調控網絡，網絡由1個circRNA節點、2個miRNA節點、3個預后相關核心靶基因節點組成（圖6）。

圖6 HCC預后相關circRNA-miRNA-核心靶基因網絡圖Fig.6 Network of circRNA-miRNA-core target genes related to the prognosis of HCC

3 討論

肝癌具有難診斷、難治療、易轉移、易復發等臨床特點［7］，除早期可進行手術切除和肝移植外，幾乎無根治性治療方法。因此，深入探討肝癌發病機制，尋找肝癌新的特異性生物靶點，實現早期診斷和治療尤為重要。circRNA由于其自身性質穩定、表達具有時空特異性等天然優勢，具有成為腫瘤生物標志物的先天條件［8］。近來研究［9］表明，circRNA在肝癌等多種癌癥中異常表達，通過ceRNA機制吸附miRNA參與腫瘤的發生發展。

本研究通過對數據集GSE97332和GSE164803進行差異表達分析，篩選出1個circRNA：hsa_circRNA_0000301，提示該circRNA在HCC中具有一定的特異性。研究［10］表明，circRNA_0000301位于11號染色體上，其親本基因為SPL1，circRNA_0000301參與乳腺癌的發生發展，但其在肝癌中的作用尚不清楚。進一步預測出與circRNA_0000301相結合的miRNA及下游靶基因，并構建ceRNA網絡圖。應用DAVID數據庫對靶基因進行GO和KEGG功能富集分析，最后通過PPI網絡及預后分析篩選出3個預后相關核心靶基因，分別為EIF4E、PRKACB和NRAS，并構建出circRNA-miRNA-核心靶基因調控網絡。

GO分析結果顯示，靶基因在RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程等功能存在富集。研究［11-13］表明，泛素介導的蛋白水解在腫瘤發生中發揮重要作用，如參與調節細胞周期進展、腫瘤轉移等。KEGG分析結果表明靶基因可能在與HCC發生密切相關的MAPK信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路中發揮作用。細胞內信號通路的失調可引起細胞增殖與凋亡異常，導致細胞癌變的發生［14］。

研究［15］表明，EIF4E基因編碼在真核翻譯起始中起關鍵作用的蛋白分子，EIF4E的高表達可誘導細胞周期、細胞生長和血管生成等相關蛋白的表達上調，影響癌癥的發生發展。據報道［16］，EIF4E在HCC樣本中表達升高，且與患者的不良預后相關，可作為肝癌患者的獨立預后指標。PRKACB基因編碼cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位 β，該蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，可調控細胞增殖、分化等多種細胞進程，參與腫瘤的生長及轉移。YE等［17］研究發現，miR-302可靶向PRKACB抑制肝癌細胞的增殖和遷移。NRAS基因編碼的N-Ras蛋白參與RAS/MAPK信號通路，調控細胞生長、增殖等過程。索拉菲尼是肝癌治療的一線藥物，研究［18］發現，NRAS在索拉菲尼耐藥的肝癌細胞中顯著高表達，敲除NRAS后可增強拉索菲尼對耐藥細胞的治療效果。

綜上所述，本研究由生物信息學方法篩選出的3個HCC預后相關基因均在HCC的發生發展中發揮重要作用。本研究首次發現了可能與HCC發生密切相關的circRNA（hsa_circRNA_0000301），并構建出與HCC預后相關的circRNA-miRNA-核心靶基因ceRNA調控網絡，為進一步挖掘肝癌發生的分子機制，尋找HCC潛在的circRNA診斷標志物提供一定的研究依據。