免疫原性細胞死亡相關基因對膀胱癌預后分型及免疫治療的影響

白洋洋，陳瑞廷，孫繼建，郭依琳

（1.河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）泌尿外科，鄭州 450002；2.鄭州大學第二附屬醫院婦科腫瘤研究中心，鄭州 450014）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，發病率居全世界惡性腫瘤第10位，每年新增超57萬人次［1-2］。在我國，每年新診斷BC患者約有8萬例，死亡率占所有惡性腫瘤的1.1%［3］。臨床中70%的BC為非肌層浸潤性，治療首選保留膀胱的經尿道膀胱腫物切除術，但術后易復發；30%為肌層浸潤性或已發生遠處轉移，治療方式除手術外多聯合以順鉑為基礎的全身治療，但化療不良反應多，患者耐受性差，且容易形成耐藥［4］。近年來隨著免疫療法和免疫檢查點抑制劑在BC中的應用，一定程度上改善了患者預后，成為BC治療中的熱點。但是腫瘤組織的低免疫原性和免疫逃逸使機體難以形成持續的免疫應答，削弱了免疫治療的效果。因此，探究BC免疫治療的潛在分子機制有助于患者的預后判斷和治療方法的選擇。

免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）作為調節性細胞死亡的一種，在具有免疫能力的宿主中激活適應性免疫，釋放損傷相關的分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），增強抗腫瘤免疫效應［5］。最新研究［6-7］表明在ICD誘導化療后，腫瘤會從“冷”變“熱”，從而增強免疫檢查點抑制劑的療效。因此，本研究基于ICD相關基因構建BC預后模型并預測其腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME），以期為BC的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據下載和處理

通過癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫（http：//www.tcga.org/）下載412例BC組織和19例正常膀胱組織的轉錄組數據、體細胞突變數據和臨床特征數據。下載數據截止日期為2022年7月24日。

1.2 ICD相關基因表達分析

檢索PubMed、Embase和CNKI數據庫得到的34個ICD相關基因［8］，包括ATG5、BAX、CALR、CASP1、CASP8、CD4、CD8A、CD8B、CXCR3、EIF2AK3、ENTPD1、FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IFNGR1、IL10、IL17A、IL17RA、IL1B、IL1R1、IL6、LY96、MYD88、NLRP3、NT5E、P2RX7、PDIA3、PIK3CA、PRF1、TLR4和TNF。在R軟件（版本3.6.2）中使用“limma”包對ICD相關基因進行兩獨立樣本Wilcoxon秩和檢驗比較BC和正常膀胱組織樣本間的表達差異，并用“pheatmap”包繪制ICD相關基因表達的熱圖。

1.3 一致性聚類識別分析

在R軟件中使用“ConsensusClusterPlus”包對34個ICD相關基因進行聚類分析，評估TCGA BC隊列中ICD相關的分子亞型。選擇k=2對樣本分型，將樣本分為ICD高評分組和ICD低評分組。該過程重復1 000次以保證結果的穩定可靠。

1.4 篩選差異表達基因（differential expression gene，DEG）和功能富集分析

在R軟件中使用“limma”包篩選2組ICD亞型之間的DEG。篩選標準為|logFC|>1，調整后的P<0.05。在R中使用“clusterProfiler”包對篩選出的DEG進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析，P<0.05為差異有統計學意義。

1.5 體細胞突變分析

將從TCGA數據庫下載的“maf”格式體細胞突變數據，在R中使用“Maftools”包繪制瀑布圖，對2組ICD亞型的突變結果進行可視化分析。

1.6 免疫浸潤分析

利用ESTIMATE方法評估2組ICD亞型每個樣本中Immune分數、Stromal分數和Estimate分數，即免疫組分、基質組分和總組分。利用CIBERSORT反卷積算法計算2組ICD亞型中CD8+T細胞、漿細胞、活化NK細胞、調節性T細胞等22種免疫細胞轉錄特征。R軟件“limma”包對ICD高評分組和ICD低評分組的樣本進行免疫檢查點（PD-L1、CTLA4等）和HLA（HLA-A、HLA-B等）基因表達差異的比較，P<0.05為差異有統計學意義。

1.7 預后模型建立

利用R軟件“Survival”包對34個ICD相關基因進行單因素Cox回歸分析。用最小絕對值選擇與收縮算子（least absolute selection and shrinkage operator，LASSO）Cox回歸算法確定7個基因（P<0.05）并建立風險預后模型。計算每例BC患者的風險評分，并將其分為高風險組和低風險組，繪制生存曲線。單因素和多因素Cox分析評估預后風險模型和臨床特征對BC預后的預測價值。

2 結果

2.1 ICD相關基因在BC中的表達

本研究共納入412例BC組織和19例正常膀胱組織，利用R軟件對431例樣本中34個ICD相關基因進行分析。結果顯示，P2PX7、IL6、ENTPD1、LY96、CD4、NLRP3、NT5E和TLR4基因在BC組織中表達下調，而FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IL17RA、CASP8、MYD88、IFNB1、BAX、CALR和PDIA3在BC組織中表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）。繪制ICD相關基因表達的熱圖，見圖1。

圖1 ICD相關基因在膀胱癌和正常膀胱中的表達熱圖Fig.1 Expression of ICD-related genes in bladder cancer and normal tissue

2.2 BC中的2種ICD相關亞型

一致性聚類分析確定了2種ICD相關的分子亞型，即ICD高評分組和ICD低評分組。繪制2組的Kaplan-Meier曲線，結果發現ICD低評分組中位生存期為2.37（95%CI：1.87～3.89）個月，ICD高評分組中位生存期為5.12（95%CI：2.75～8.92）個月，log-rank檢驗結果顯示2組的生存時間差異有統計學意義（χ2=6.9，P=0.008），見圖2A。為了進一步探究2種ICD相關的分子亞型之間生物學功能和分子作用機制的差異，進一步比較ICD高評分組和ICD低評分組之間的DEGs。按照|logFC|>1，調整后的P<0.05的標準，共篩選出781個DEGs，繪制差異最明顯的前30個DEG的熱圖，見圖2B。對這781個DEG進行GO和KEGG通路的功能富集分析，GO功能富集分析結果顯示，在生物學功能上主要富集于T細胞激活、細胞活化的陽性選擇、免疫球蛋白生成等過程；細胞成分的變化主要與T細胞受體復合物、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）蛋白復合物等有關；分子功能層面主要富集于抗原結合、MHC蛋白復合物結合、免疫球蛋白受體結合等。KEGG富集分析顯示這些DEG在T細胞激活、B細胞激活、T細胞活化的正向調節、免疫反應激活、T細胞增殖、免疫球蛋白生成等信號通路中顯著豐富。

圖2 膀胱癌中的2種ICD相關亞型Fig.2 Two ICD-related subtypes in patients with bladder cancer

2.3 BC中體細胞突變分析

對ICD高評分組和ICD低評分組之間體細胞突變的差異進行分析，繪制瀑布圖。結果顯示，ICD高評分組的體細胞突變率為95.00%，ICD低評分組的體細胞突變率為93.92%，組間差異無統計學意義（χ2=0.16，P=0.689）。2組中最常見的突變有TP53、TTN、KMT2D、MUC16和ARID1A等。ICD高評分組中TP53和TTN突變頻率最高，分別占54%和57%，見圖3。

圖3 2種ICD相關亞型的體細胞突變分析Fig.3 Somatic mutation analysis of two ICD-related subtypes

2.4 2種ICD相關亞型免疫浸潤分析（圖4～6）

圖4 2種ICD相關亞型的TMEFig.4 Tumor-immune microenvironment of two ICD-related subtypes

圖5 2種ICD相關亞型中22種免疫細胞的差異Fig.5 Expression variation in 22 immune cells in two ICD-related subtypes

圖6 2種ICD相關亞型中免疫檢查點和HLA基因的表達Fig.6 Expression of immune checkpoint and HLA gene in two ICD-related subtypes

利用ESTIMATE評估ICD高評分組和ICD低評分組TME的差異。結果顯示，ICD高評分組的免疫組分（Z=-12.983，P<0.001）、間質組分（Z=-6.783，P<0.001）和總組分（Z=-10.515，P<0.001）均高于低風險組，而ICD高評分組的腫瘤純度低于ICD低評分組（Z=-10.515，P<0.001），表明ICD高評分組富含更多的免疫細胞成分，而ICD低評分組腫瘤細胞含量更高。

利用CIBERSORT反卷積算法計算2組ICD亞型中CD8+T細胞、漿細胞、活化NK細胞、調節性T細胞等22種免疫細胞的轉錄特征。結果顯示，ICD高評分組中CD8+T細胞、激活的CD4+記憶T細胞、濾泡輔助性T細胞和M1型巨噬細胞的含量更高，而ICD低評分組中靜止的CD4+記憶T細胞、激活的樹突狀細胞、M0型巨噬細胞、調節性T細胞的含量更高。

進一步分析免疫檢查點（PD-L1、CTLA4等）和HLA（HLA-A、HLA-B等）基因在ICD高評分組和ICD低評分組之間的表達差異，結果顯示，免疫檢查點和HLA基因在ICD高評分組表達高于ICD低評分組。以上結果提示，ICD高評分組與免疫炎癥型相關，而ICD低評分組與免疫沙漠型相關。

2.5 風險預后模型的建立

對34個ICD相關基因進行單因素Cox回歸分析，結果顯示，CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88與BC患者的預后相關，見圖7A。利用LASSO Cox回歸對這7個基因建立BC的風險預后模型，CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88的系數分別為0.54，-0.12、-0.01、-0.49、-0.46、-0.28和-0.08。根據中位風險評分，將患者分為高風險組和低風險組。繪制Kaplan-Meier曲線，log-rank檢驗結果顯示高風險組的預后比低風險組差（χ2=16.2，P<0.001），見圖7B。對建立的預后模型和臨床特征進行單因素和多因素Cox回歸分析，結果顯示，年齡、臨床分期和風險評分是BC患者預后的獨立影響因素，可以較好地預測BC患者的預后，見圖7C、7D。

圖7 膀胱癌中預后模型的建立Fig.7 Establishment of a risk model for the prognosis of bladder cancer

3 討論

20世紀70年代，MORALES等［9］首次報道膀胱內灌注卡介苗可激活機體免疫系統和誘導炎癥反應以發揮抗腫瘤效應。近年來，腫瘤的免疫治療在BC治療中取得快速發展，為局部進展和轉移性BC的治療提供了新方向［10］。然而，免疫治療在BC治療中取得重大突破的同時，也面臨著一些挑戰和問題，如一部分BC患者對免疫治療完全沒有響應，即免疫沙漠。ICD可能發生在腫瘤治療過程中，激活抗原特異性適應性免疫應答，將腫瘤對免疫治療由“冷”轉“熱”［11］。據此，本研究基于ICD相關基因的表達，在BC中構建了2個ICD亞型，并利用LASSO Cox回歸構建了BC風險預后模型，為BC的臨床治療提供依據。

本研究分析了34個ICD相關基因在412例BC組織和19例正常組織中的表達差異。結果顯示，P2PX7、IL6、ENTPD1、LY96、CD4、NLRP3、NT5E和TLR4基因在BC組織中表達下調，而FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IL17RA、CASP8、MYD88、IFNB1、BAX、CALR和PDIA3在BC組織中表達上調。TLR4是一種免疫調節因子，參與機體免疫應答的起始階段，正常情況下僅表達于機體免疫細胞表面，也表達于多種惡性腫瘤細胞表面［12］。有研究［13-14］發現脂多糖能活化TLR4信號通路，可能參與BC細胞免疫逃逸，而苦參堿則可能通過調控TLR4抑制BC小鼠模型的腫瘤生長和誘導凋亡，提高CD4+/CD8+水平。PDIA3是一種伴侶蛋白，在多種免疫細胞中高表達，影響多種腫瘤的發生發展。有研究［15］發現PDIA3在BC中高表達，可以作為BC診斷的生物標志物。

本研究通過聚類分析在BC中確定了2種聚類分型，即ICD低評分組和ICD高評分組。ICD低評分組和ICD高評分組間共篩選了781個DEGs，GO和KEGG通路的功能富集分析結果顯示，這些DEG主要富集于免疫相關的通路以及腫瘤的發生、發展和轉移等生物過程中，提示ICD低評分組和ICD高評分組間存在TME差異。ESTIMATE和CIBERSORT反卷積算法進一步發現ICD高評分組具有較高的免疫細胞浸潤，免疫檢查點基因和HLA基因在ICD高評分組表達更高，進一步證實了ICD高評分組具有較高的免疫細胞浸潤，與免疫炎癥型有關；而ICD低評分組則與免疫沙漠有關。免疫炎癥型，又稱為熱腫瘤，表現為TME中存在大量免疫細胞浸潤，對于免疫檢查點抑制劑更敏感［16］。免疫沙漠型，又稱為冷腫瘤，由于缺少T細胞的激活會導致免疫耐受和免疫忽略，對免疫檢查點抑制劑治療不敏感［17］。因此，ICD高評分組可能對免疫檢查點抑制劑敏感，為免疫治療的應用提供參考依據。

為了更好地預測BC患者的預后結局，本研究利用LASSO回歸分析對CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88建立風險預后模型，并通過單因素和多因素Cox回歸驗證該模型是BC患者的獨立預后因素，具有較好的預后價值。相似地，WANG等［18］在頭頸鱗狀細胞癌基于ICD相關基因的表達構建了風險預后模型，證明了該預后模型對患者預后預測的價值。

綜上所述，本研究分析了ICD相關基因在BC組織中的表達情況，建立了2種ICD相關的亞型，驗證了ICD亞型與BC的TME變化之間的關系，并據此構建了與ICD相關的風險預后模型，為BC患者免疫治療的提供指導價值。