藍莓3個ZIP轉運子的克隆及其生物學功能

沈芷琦 朱林梢 余穎 陶歆鈺 周非 陳僑月

摘 要：藍莓Vaccinium spp.的生長代謝極大程度受到金屬離子平衡的影響，ZIP轉運蛋白家族在調節植物體金屬穩態中起著關鍵性作用，但目前有關藍莓ZIP轉運蛋白的相關研究較少。為探究藍莓ZIP轉運蛋白基因對鐵（Fe）、 鋅（Zn）、 鎘（Cd）等金屬離子的吸收轉運機制，以北高叢藍莓布里吉塔為研究材料，對藍莓ZIP基因家族成員進行克隆，采用生物信息學方法分析得到候選基因的核苷酸序列、氨基酸序列、跨膜結構域，對比其他植物的ZIP家族基因，構建系統進化樹并篩選得到高相似性的重點研究對象；通過添加金屬水培藍莓的VcZIPs基因表達量分析，探究藍莓中ZIP轉運子的生物學功能；通過轉基因酵母金屬耐性分析試驗，驗證VcZIPs異源表達時的功能。結果表明：克隆得到8個VcZIPs全長cDNA序列，其中篩選出3個轉運子VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具有ZIP家族的典型二級結構，或為潛在的ZIP家族成員。qRTPCR結果表明，藍莓葉部ZIP轉運子的基因轉錄水平普遍受到過量金屬離子的抑制；藍莓根部的VcZIPs基因表達普遍受根際過量金屬離子誘導，VcZIP4基因的表達量在缺Fe、過量Fe以及超量Cd處理組中分別上調為對照（CK）的5.3、86.5、和45.4倍，VcZIP7基因的表達量在過量Fe處理組中上調為對照的27.2倍，VcZIP 9基因的表達量在過量Cd、超量Cd條件下響應最顯著，分別上調為對照（CK）的142.8倍和360.2倍。轉基因酵母金屬耐性分析試驗表明，VcZIP7可能具有鎘轉運的功能；VcZIP4、VcZIP9均能介導錳的轉運而VcZIP7不具備轉運錳的能力；VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9均具有鐵轉運功能，其中VcZIP7的鐵轉運功能最高，其相對較低的表達可能是藍莓鐵營養低效的重要原因。研究結果可為揭示藍莓ZIP金屬轉運子家族的運輸機制奠定基礎。

關鍵詞：藍莓；ZIP轉運蛋白；克隆；生物學

中圖分類號：S 663.9? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0020-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.004

Abstract： The growth and metabolism of blueberry were greatly affected by the balance of metal ions. ZIP transporter protein family played a key role in regulating the metal homeostasis in plants. However， there were few studies on ZIP transporter protein in blueberry. In order to explore the absorption and transport mechanism of ZIP transporter protein gene in blueberry to the metal ions， such as ferric ion （Fe）， zinc （Zn）， cadmium （Cd）， the members of ZIP gene family in blueberry were cloned by using the northern highbush blueberry Brigitta as the research material. The nucleotide sequence， amino acid sequence and transmembrane domain of the candidate genes were obtained by using the bioinformatics method. Compared with the ZIP family genes of other plants， the phylogenetic tree was constructed and the key research objects with high similarity were screened. The biological function of ZIP transporters in blueberry was explored by analyzing the expression of VcZIPs gene in blueberry with metal hydroponics. The function of heterologous expression of VcZIPs was verified by carrying out the metal tolerance analysis test of transgenic yeast. The results showed that： eight fulllength cDNA sequences of VcZIPs were cloned， among which the three transporters， including VcZIP4， VcZIP7 and VcZIP9 had the typical secondary structure of the ZIP family or were the potential members of the ZIP family. The results of qRTPCR showed that the gene transcription level of ZIP transporter in the leaves of blueberry was generally inhibited by the excessive metal ions. The expression of VcZIPs genes in the roots of blueberry was generally induced by the excessive metal ions in rhizosphere. The expression level of VcZIP4 gene was upregulated by 5.3， 86.5， and 45.4 times compared with the control （CK） in the deficient Fe， excessive Fe and excessive Cd treatment groups， respectively. The expression level of VcZIP7 gene was upregulated by 27.2 times compared with the control in the excessive Fe treatment group. The expression level of VcZIP9 gene was the most significant under the conditions of excessive Fe and excessive Cd treatments， which was upregulated by 142.8 times and 360.2 times compared with the control （CK）， respectively. The metal tolerance analysis of transgenic yeast showed that， VcZIP7 might have the function of cadmium transport. Both VcZIP4 and VcZIP9 could mediate the transport of manganese， while VcZIP7?didn′t have the ability to transport manganese. VcZIP4， VcZIP7 and VcZIP9 all had the function of iron transport， among which VcZIP7 had the highest function of iron transport， and its relatively low expression might be an important reason for the low efficiency of iron nutrition of blueberry. The results could lay a foundation for revealing the transportation mechanism of the ZIP metal transporter family of blueberry.

Key words： Blueberry； ZIP transporter protein； Cloning； Biology

微量元素是植物生長發育所必需的成分，主要以離子的形式存在，參與多種生化反應，在植物的生長發育和代謝過程中至關重要[1]。缺乏或過量的礦質元素，如鋅、鐵和銅，會對植物體內的許多關鍵的生物化學反應和代謝途徑產生嚴重的影響[2]。過量攝入某些重金屬元素可能導致植株生長受阻、生理紊亂甚至死亡。因此，為確保植物正常生長和發育，調節植物體內的金屬元素平衡極為關鍵[3-5]。

植物中金屬離子轉運蛋白家族種類繁多，目前已得到鑒定的包括 ZIP（Znregulated，Ironregulated transporterlike Protein）家族、NRAMP（Natural Resistance And Macrophage Protein）家族、CDF（CationDiffusion Factor）家族等。這些轉運蛋白調節植物體內金屬離子的吸收和運輸，在植物生長調節過程中承擔重要角色[6]。ZIP家族是植物中最先被分離出來的轉運蛋白，定位在細胞膜上，其中兩個主要成員是ZRT（Zincregulated transporter）和IRT（Iron regulated transporter），參與調控Zn、Fe、Mn、Cu等金屬元素的吸收及Cd、Ni、Co等重金屬元素的轉運。目前已克隆得到的ZIP家族成員主要在擬南芥[7]、水稻[8]、大麥[9]、玉米[10]等模式植物中，在擬南芥中克隆得到15個成員（AtIRT1～AtIRT3、AtZIP1～AtZIP12）；水稻中克隆得到18個成員（OsIRT1、OsIRT2、OsZIP1～OsZIP16）；大麥中克隆得到13個成員（HvIRT1、HvZIP1～HvZIP3、HvZIP5～HvZIP8、HvZIP10～HvZIP11、HvZIP13～HvZIP14、HvZIP16）；玉米中克隆得到9個成員（ZmIRT1、ZmZIP1～ZmZIP8）。現有研究表明，ZIP轉運蛋白主要承擔多種二價金屬陽離子的轉運，如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+等[11]。同時，編碼ZIP蛋白的不同基因受環境金屬離子濃度的調節，在植物的地上部、根部及種子等部位的表達中呈現出差異性[12-16]。

在部分模式植物中，ZIP轉運蛋白家族已被證實能夠促進Zn、Fe、Mn和Cu等金屬元素的吸收、運輸和分隔，在調節金屬離子穩態中起到至關重要的作用，而藍莓ZIP轉運子家族的相關研究卻鮮見報道。藍莓在非酸性根際及有機質匱乏的土壤里常出現葉片黃化、脈間失綠等典型缺Fe癥狀。因此栽培藍莓時常常采取降低土壤pH值的方法來增加土壤中有效Fe的濃度，從而提高藍莓對鐵的吸收和利用效率。然而，土壤酸度的上升會同時提高其他重金屬離子的可溶性，導致藍莓生長過程中表現出生理性重金屬中毒，對藍莓的品質和產量造成嚴重的影響[17-19]。因此，研究藍莓對Cd、Zn等重金屬毒害的耐受性及其相關機理具有重要的實踐意義。本研究從藍莓中克隆得到3個ZIP轉運蛋白家族基因cDNA，并利用qRTPCR和轉基因酵母金屬耐性分析試驗，研究ZIP轉運子的表達模式及金屬轉運功能，以揭示藍莓對金屬元素的吸收利用機制，提升藍莓中礦質元素的吸收效率并緩解重金屬的脅迫作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用長勢相近的1年生北高叢藍莓布里吉塔（Brigitta），大腸桿菌（Escherichia coli）感受態DH5α，酵母表達載體pDR195，酵母材料包括：野生型DY1457（ade can1100oc his3 leu2 trp1 ura3），鋅鎘敏感型突變體△zrc1（MAT α；his△1；leu2△0；met15△0；YMR243：：kanMX4），錳吸收缺陷型突變體△smf1（SLY8;MAT α ura3 lys2 ade2 trp1 his3 leu2 smf1：：HIS3），鐵吸收缺陷型突變體DDY4（ura3 trp1 leu2 can1）。

1.2 儀器和試劑

儀器設備選用PCR擴增儀、電泳儀、高速冷凍離心機、水浴鍋、恒溫振蕩器、-80℃超低溫冰箱、電子天平、pH計、凝膠成像系統、顯微鏡、NanoDrop 2000分光光度計、熒光定量 PCR儀、人工氣候培養箱、氧氣泵等。

試劑選用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit試劑盒（TaKaRa，日本）、CTAB提取液、Hoagland營養液、SDURA培養基等。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓總RNA提取及ZIP家族基因克隆 參照Vashisth等[20]和Tripti等[21]改良后的CTAB法提取藍莓葉、根系總RNA，利用檢測儀對樣本RNA濃度進行檢測，并置于-80℃保存。采用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit試劑盒（TaKaRa，日本）合成得到cDNA的第一鏈，并置于-20℃溶液中保存。以實驗室前期已知的VcIRT1特異序列為探針，對比藍莓的基因數據庫，得到VcIRT1基因的同源序列，并采用ExPASy Translate tool軟件反向推導出氨基酸序列，通過NCBI的Blast功能篩選得出可能屬于ZIP金屬轉運蛋白家族的各組同源序列。采用Premier 5.0設計引物，以藍莓葉、根系總cDNA為模板，克隆得到目的基因片段，并將片段通過載體pMD19T Vector轉化至大腸桿菌感受態DH5α，用于驗證目的基因片段的可靠性。

1.3.2 藍莓ZIP家族基因核苷酸序列、氨基酸序列分析及系統發育樹構建 采用ExPASy Translate tool軟件分析測序所得的候選ZIP家族基因的核苷酸序列，推導得知其氨基酸序列；采用TMHMM 2.0軟件分析候選ZIP金屬轉運子的跨膜結構域；采用NCBI的GenBank數據庫獲取其他植物中已知的ZIP家族基因的氨基酸序列，通過MEGA5.0軟件構建系統進化樹，并進行多序列比對分析。將候選ZIP金屬轉運子分析得到的二級結構與ZIP家族的典型二級結構進行比對，篩選得到高相似性的重點研究對象，進一步驗證其對金屬轉運的能力。

1.3.3 添加金屬離子水培對藍莓生長的影響 采用改良后的Hoagland營養液水培藍莓，參考藍莓水培中金屬離子過量的常用濃度，共設6個處理組，分別為對照（CK，含Fe 40 μmol·L-1）；過量Fe（100 μmol·L-1）；缺Fe（0 μmol·L-1）；過量Zn（50 μmol·L-1）；過量Cd（5 μmol·L-1）；超量Cd（50 μmol·L-1）。每個處理組3次重復，每次重復為10 株藍莓苗。培養30 d后，觀察不同金屬處理組中藍莓苗的根、莖、葉生長狀況。

1.3.4 添加金屬離子水培對藍莓3個ZIP家族基因表達量的影響 采用1.3.1方法提取水培處理后藍莓的葉、根系總RNA，并合成得到cDNA第一鏈，置于-20℃溶液中保存。利用Premier 5.0設計定量引物，使用ABI Prism 7000定量擴增儀進行實時熒光定量PCR分析，對比不同處理組的藍莓葉、根中VcZIPs基因表達量的差異。采用 2-ΔΔCt法通過內參基因 GAPDH對數據進行歸一化處理。

1.3.5 轉基因酵母對金屬Cd、Mn、Fe的耐性分析 （1）pDR195VcZIPs表達載體構建及酵母轉化 以載體pDR195為基礎，利用雙酶切-T4連接法構建轉基因酵母金屬耐性分析試驗表達載體，將VcZIPs分別連接至pDR195，構建重組質粒并轉化至大腸桿菌感受態DH5α進行擴增，驗證目的片段的有效性。酵母轉化方法參照Gietz等[22]提出的醋酸鋰酵母轉化法，將pDR195VcZIPs重組質粒分別轉入野生型DY1457、鋅鎘敏感型突變體△zrc1、錳吸收缺陷型突變體△smf1、鐵吸收缺陷型突變體DDY4中，用于驗證候選基因在缺陷型酵母中是否起到金屬運輸功能互補的作用。（2）轉基因酵母金屬耐性分析 依據不同突變體酵母的營養需求，分別采用缺失相應氨基酸的選擇性SDURA液體培養基篩選轉化成功的酵母單克隆，并置于液體培養基中培養至濃度達到OD600=1.0。針對不同的缺陷型酵母的金屬吸收特性，在缺失相應氨基酸的選擇性SDURA固體培養基中進行不同金屬處理，以觀察轉化后的酵母對金屬的耐性是否改變。（a）鋅鎘敏感型突變體△zrc1：選擇性SDURA固體培養基（CK）、添加50 μmol·L-1CdCl2的SDURA固體培養基；（b）錳吸收缺陷型突變體 smf1：選擇性SDURA固體培養基（CK）、添加20 μmol·L-1EGTA+15 mmol·L-1 MES的SDURA固體培養基；（c）鐵吸收缺陷型突變體DDY4：選擇性SDURA固體培養基（CK）、pH=5.6 SDURA固體培養基、5.8 SDURA固體培養基。

將OD600=1.0的酵母菌液以10倍梯度連續稀釋4次，獲得OD600=0.1、0.01、0.001、0.0001的梯度濃度菌液，分別點板至各處理組的SDURA固體培養基上。在30℃恒溫箱中培養2～3 d后對比生長狀況，并拍照記錄試驗結果[23]。

2 結果與分析

2.1 藍莓ZIP家族基因生物信息學分析

8個ZIP基因編碼的多肽長約350（337～397）個氨基酸。兩兩對比顯示，序列間存在較大差異，相似性低至19%（VcZIP2和VcZIP7），高達91%（VcZIP9和VcZIP11）。通過8個ZIP家族基因的轉膜域預測結果對比篩選結果顯示，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具有ZIP家族的典型二級結構，包括8個轉膜域、C末端的短肽且在Ⅲ與Ⅳ轉膜域間存在一序列長度多變的富含組氨酸的鏈。為進一步確認VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具備潛在的金屬轉運功能，將上述3個基因與擬南芥中AtIRT1～AtIRT3這3個典型金屬轉運基因進行聯配，分析結果顯示基因結構類似。因此，本試驗重點研究VcZIP4、VcZIP7和VcZIP9轉運子的生物學功能。

將8個藍莓ZIP家族基因序列和30個已知植物ZIP家族基因序列聯配，并通過MEGA 6.0軟件構建系統進化樹（圖1）。結果顯示，根據分支長度與垂直距離，VcZIP4與AtZIP6基因的進化分歧時間短，蛋白質相似性為67%；VcZIP7和AtZIP7基因的親緣關系較近，位于同一分支；VcZIP9基因同樣位于VcZIP7和AtZIP7所在分支。

2.2 添加金屬離子對藍莓表觀生長情況的影響

1年生藍莓苗經過Fe、Zn、Cd金屬水培處理30 d后，各處理組藍莓的生長均表現出典型特征（圖2）。對照處理（CK）生長環境中，藍莓植株莖稈粗壯，葉片生長茂盛且呈深綠色，根系發達，根尖有明顯伸長；過量Fe組植株矮小，藍莓植株莖稈細長，葉片緣呈杯狀卷起或卷皺，頂端葉片呈現銹色，根系生長異常，局部呈現棕褐色；缺Fe組枝頂端嫩葉出現典型缺鐵癥狀，如脈間失綠黃化、葉片卷曲等，根系生長受到明顯抑制，新根量低；過量Zn組藍莓植株較為矮小，枝條稀疏，葉片脫落嚴重，少數葉片葉尖出現褐色，生長受到抑制；過量Cd組根尖呈黑褐色，嫩芽萎蔫，老葉葉緣呈褐色失綠；超量Cd組根系受損嚴重，脆弱易斷，嫩葉嚴重萎蔫，葉色由綠色轉褐色。

2.3 添加金屬離子水培處理對藍莓ZIP家族基因表達量的影響

利用分段克隆再拼接的方法成功分離得到藍莓VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9等3個轉運子的全長cDNA，并在此基礎上，采用定量PCR檢測VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9等3個基因的相對表達量。經過不同金屬離子水培處理30 d后的藍莓植株中，其VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因的表達水平均表現出差異顯著（圖3）。在葉部，3個轉運子的基因轉錄水平普遍受到抑制，相對于對照，降幅為58.8%～99.9%。根部的變化則更為復雜，其中缺Fe、過量Fe以及超量Cd處理條件下藍莓根部的VcZIP4基因的表達顯著上調，轉錄水平分別為對照的5.3、86.5和45.4倍；VcZIP7基因的表達量在過量Fe處理條件下上調明顯，達到27.2倍，其余金屬離子過量的表達量無顯著變化（圖3B1、B2）；VcZIP9基因表達量在根際各金屬離子過量條件下表達量均大幅上升（圖3C1、C2），其中在過量Cd、超量Cd條件下分別達到對照的142.8倍和360.2倍。

2.4 轉基因酵母金屬耐性分析與異源表達研究

2.4.1 △zrc1異源表達VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對鎘的耐性 鋅鎘敏感型突變體△zrc1轉化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在富鎘培養基上表現出不同長勢，用于揭示ZIP轉運子在酵母中對鎘的轉運能力。由圖4可知，在添加50 μmol·L-1 CdCl2處理的培養基上，與表達空載體pDR195的酵母菌株相比，轉化VcZIP4或VcZIP9提升了△zrc1突變體對鎘的耐受性，說明轉化了VcZIP4或VcZIP9基因的酵母可以互補這一抑制表型；而轉化VcZIP7使得突變體對鎘更加敏感，生長明顯受到抑制，這說明VcZIP7的轉化提高了△zrc1突變體對鎘的敏感性，或在酵母中承擔介導鎘轉運的功能。

2.4.2 △smf1異源表達VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對錳的耐性 錳吸收缺陷型突變體△smf1轉化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在缺錳培養基上表現出不同長勢，用于揭示ZIP轉運子在酵母中轉運鐵的能力。由圖5可知，在正常培養基上，表達空載體pDR195的酵母生長狀況均良好；在添加20 μmol·L-1 EGTA和15 mmol·L-1 MES的缺錳培養基上，表達VcZIP4和VcZIP9的突變體依舊生長良好，而表達空載體pDR195或VcZIP7的突變體受到明顯的生長抑制；說明VcZIP4、VcZIP9基因能夠提高酵母對錳的吸收效率，或在酵母中承擔介導錳吸收的功能。

2.4.3 DDY4異源表達VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對鐵的耐性 鐵吸收缺陷型突變體DDY4轉化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在不同鐵濃度培養基上表現出不同長勢，用于揭示ZIP轉運子在酵母中轉運鐵的能力。由圖6可知，隨著pH5.6升至pH 5.8，培養基中可溶性鐵含量降低，表達空載體pDR195的酵母長勢隨之發生減弱。然而，表達VcZIP4、VcZIP9、VcZIP7基因的酵母長勢良好，特別是轉化VcZIP7或VcZIP9的酵母表現出了明顯的生長優勢，與正常Fe濃度的培養基相比，其生長幾乎沒有受到抑制。因此得出推斷，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在酵母中或承擔介導鐵吸收的功能。

3 討論

藍莓對土質要求極為嚴格，其Fe營養具有明顯的低效性。同時，藍莓強烈的嗜酸性使根際其他重金屬被活化也極易導致藍莓的生理性重金屬中毒，這些因素嚴重影響藍莓的產量和質量[18]。作為植物中最主要的金屬離子轉運子，ZIP家族基因主要參與了金屬元素的跨膜運輸過程[8，24]。生物信息學分析顯示，藍莓ZIP金屬轉運蛋白家族中至少含有8個家族成員，在所構建的ZIP基因系統進化樹中，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因分別歸屬于3個不同的大類中，說明這3個基因在進化中距離較遠，并不是相同基因的不同拷貝，或許在植物體內承擔不同的功能[25]。也有學者認為，ZIP轉運子在第Ⅲ與Ⅳ轉膜域之間的這段富含組氨酸的鏈可能是ZIP基因結合金屬離子的靶位，對ZIP基因轉運底物的選擇性具有決定作用[23]。因此，本研究重點對這3個基因進行克隆及生物學功能的研究。

定量PCR結果顯示，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因對在不同的金屬處理組表現出完全不同的表達模式，在此基礎上推斷，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在藍莓的生物學功能上可能存在一定的差異性[23]。VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在根部的響應均要強于葉部的響應，這可能是由于上述基因主要在根部承擔離子吸收、轉運的功能[9]。當根際Cd過量時，藍莓根部的VcZIP4和VcZIP9基因的表達量上調，但二者并不具備Cd的轉運功能，推測VcZIP4和VcZIP9基因的過量表達可能是為了提高胞內Fe等離子濃度以拮抗Cd毒害作用。在擬南芥[26]、水稻[27]中的研究同樣揭示了ZIP轉運子的過量表達對于環境Cd毒害脅迫具有緩解作用。過量Zn（50 μmol·L-1）處理時，VcZIP4在藍莓葉及根部的表達水平未出現明顯的變化，暗示該基因不參與鋅的轉運，與此類似，水稻的OsIRT1亦僅具有轉運Fe而不具備Zn的轉運功能[28-29]。缺鐵條件下，VcZIP4和VcZIP9在根部的表達明顯上調，且轉基因酵母金屬耐性分析試驗顯示二者均有轉運Fe及Mn的功能，可見，VcZIP4和VcZIP9是根中的鐵響應基因，介導鐵在根中的轉運。VcZIP7使缺陷型酵母在缺鐵培養基中長勢最好，表明其具有高效的Fe轉運功能，但缺Fe處理條件下，VcZIP7的表達并未出現顯著上調，這可能是藍莓Fe營養低效的重要原因。

本研究在一定程度上揭示了藍莓中ZIP轉運子家族的功能，在此基礎上，為進一步驗證VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因的功能，可進行擬南芥的遺傳轉化試驗，探究不同金屬濃度處理對擬南芥生長狀況的影響，以更深層次地探討上述基因的功能。

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（責任編輯：林玲娜）