海藻酸鈉固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性及其合成低聚果糖的研究

肖余俊 葉婷娥 余超凡 何文錦 鄭毅

摘 要：果糖基轉(zhuǎn)移酶是酶法生產(chǎn)低聚果糖的關(guān)鍵催化劑，固定化酶具有催化特性穩(wěn)定、重復(fù)使用及節(jié)省用酶成本的優(yōu)勢，開展固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化特性的研究對其工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。以海藻酸鈉為載體，采用包埋法固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，探究其最適催化溫度、熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性、酶催化動力學(xué)等催化特性，并對固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的應(yīng)用進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：海藻酸鈉包埋法固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適催化溫度為50℃，pH值為5.0，酶學(xué)動力學(xué)米氏常數(shù)Km值為0.03 mg·mL-1，采用該固定化酶以蔗糖為底物可制得48.03%純度的低聚果糖。海藻酸鈉固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶相對游離酶具備更好的與蔗糖底物的親和性、更佳的溫度與pH穩(wěn)定性，具備更好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：海藻酸鈉；果糖基轉(zhuǎn)移酶；催化特性；低聚果糖

中圖分類號：Q 814? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0045-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.008

Abstract： Fructosyltransferase was a key catalyst for the enzymatic production of fructooligosaccharides. The immobilized enzyme had the advantages of stable catalytic properties， repeated use and saving the enzyme cost. The study on the catalytic properties of immobilized fructosyltransferase could provide data basis for its industrial application. The fructosyltransferase was immobilized by using the embedding method with sodium alginate as the carrier. Then， the catalytic characteristics such as the optimum catalytic temperature， thermal stability， optimum reaction pH， pH stability and enzymatic kinetics were investigated. The application of immobilized fructosyltransferase in the catalytic synthesis of fructooligosaccharides was also preliminarily studied. The results showed that the optimum catalytic temperature of fructosyltransferase immobilized by the sodium alginate embedding method was 50℃， the pH value was 5.0， and the michaelismenten constant （Km） of enzymatic kinetics was 0.03 mg·mL-1. 48.03% purity of fructooligosaccharides could be prepared by using the immobilized enzyme and sucrose as the substrate. Compared with the soluble enzyme， the sodium alginate immobilized fructosyltransferase had better compatibility with sucrose substrate， better temperature and pH stability， and had better potential for the industrial application.

Key words： Sodium alginate； Fructosyltransferase； Catalytic properties； Fructooligosaccharides

低聚果糖（Fructooligosaccharides，簡稱FOS）是一種功能性低聚糖，同時也是一種益生元。FOS屬于非還原性糖，其甜度和熱值均比蔗糖低，且FOS的甜度隨著其聚合度的增加而降低[1]。當(dāng)人食用低聚果糖后，人體消化系統(tǒng)的酶無法將其分解成葡萄糖等能引起血糖升高的小分子單糖，而是通過胃和小腸直接進(jìn)入大腸，選擇性地促進(jìn)雙歧桿菌Bifidobacterium、乳酸桿菌（Lactobacillus）等益生菌大量增殖[2-4]。腸道益生菌的數(shù)量增多及其產(chǎn)生的一些物質(zhì)能夠有效抑制各種有害菌的繁殖，改善腸道環(huán)境。食用低聚果糖不會引發(fā)齲齒，變異鏈球菌（Streptococcus mutans）等口腔微生物無法將低聚果糖轉(zhuǎn)化為酸和不溶于水的β葡聚糖[5-6]。FOS已被證實是唯一同時具有超強(qiáng)雙歧因子和水溶性膳食纖維的雙生理學(xué)特性的功能性低聚糖[7-8]。

目前酶法生產(chǎn)是工業(yè)化生產(chǎn)FOS的主要方法，該方法以蔗糖為底物，利用微生物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶（Fructosyltransferase，簡稱Ftase）的催化作用合成FOS。但如果直接使用游離的果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行催化反應(yīng)，則會出現(xiàn)酶對環(huán)境條件非常敏感、酶只能使用一次等諸多不利的情況。而固定化酶技術(shù)可以改善這種情況，利用物理或化學(xué)方法將游離酶固定在一定的空間內(nèi)，相對于游離酶不僅保留了酶的催化活性，也提高了穩(wěn)定性，對環(huán)境條件的變化更有耐受性，還能回收和重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。本研究采用海藻酸鈉包埋法制備固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，研究其催化特性及其合成FOS的應(yīng)用，以期為進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 酶源 由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室黑曲霉（Aspergillus niger）ZY1023制備的果糖基轉(zhuǎn)移酶。

1.1.2 主要試劑 海藻酸鈉（化學(xué)純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖（分析純）購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 海藻酸鈉包埋法固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備 配制濃度為1.5%的海藻酸鈉溶液，與等體積的果糖基轉(zhuǎn)移酶溶液混合并充分?jǐn)嚢杈鶆颉⒒旌先芤何胱⑸淦鲀?nèi)，逐滴打入到一定濃度的CaCl2溶液中，得到大小均勻、形狀規(guī)則的凝膠微球，并將微球置于4℃冰箱中硬化2 h。用去離子水反復(fù)沖洗微球，測量固定化酶的酶活，將剩余的固定化酶置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化特性

（1）最適催化溫度及熱穩(wěn)定性。使用由pH 5.0的乙酸乙酸鈉緩沖液配制的0.1 g·mL-1的蔗糖溶液，分別置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的溫度下進(jìn)行游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)1 h。然后分別測定每個溫度下的酶活，計算出相對酶活，繪制溫度-相對酶活曲線。（2）游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)。將游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的溫度下水浴1 h，再分別與0.1 g·mL-1的蔗糖溶液（由pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制）進(jìn)行游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)1 h。以未處理酶的酶活作為100%，測定水浴后游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活，繪制熱穩(wěn)定性曲線。（3）最適反應(yīng)pH。分別用由pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的乙酸乙酸鈉緩沖液配制的0.1 g·mL-1蔗糖溶液，在55℃下分別進(jìn)行游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)1 h，然后分別測定每個pH值下的酶活，計算出相對酶活，繪制pH值相對酶活曲線。（4）pH穩(wěn)定性。將游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶分別置于pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0的乙酸乙酸鈉緩沖液中，過夜處理后測定殘留酶活力。以未處理酶的酶活作為100%，測定過夜處理后游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活，繪制pH穩(wěn)定性曲線。（5）催化動力學(xué)。在酶促反應(yīng)體系中（游離酶：55℃、pH 5.5；固定化酶：50℃、pH 5.0）改變蔗糖底物濃度[S]，使其在反應(yīng)體系中的濃度分別為0.15、0.20、0.25、0.30 g·mL-1。測定酶促反應(yīng)的初速度V，以蔗糖底物濃度1/[S]對1/V作圖，繪制LineweaverBurk圖，從直線截距分別獲得游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖底物的米氏常數(shù)Km。

1.2.3 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的應(yīng)用 在60%的蔗糖溶液按照6 U·g-1蔗糖的加酶量添加固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，在反應(yīng)溫度為55℃、pH 5.0（乙酸乙酸鈉緩沖液）進(jìn)行催化合成，分別在催化反應(yīng)的第2、4、8、12、16、20、24 h取樣檢測低聚果糖含量。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 低聚果糖的測定 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23528-2009《低聚果糖》[9]中的HPLC法進(jìn)行測定。

1.3.2 酶活力的測定 量取0.1 g·mL-1的蔗糖溶液20 mL于三角瓶中，加入酶液（或固定化酶），在55℃、pH 5.0的條件下，于200 r·min-1的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后置于沸水浴中滅酶10 min終止反應(yīng)，用HPLC法檢測蔗果三糖含量，計算酶活力。酶活力定義：在上述酶催化反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol蔗果三糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適催化溫度

由圖1可知，游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適催化溫度分別為55℃和50℃，各自的相對酶活達(dá)到最大，經(jīng)固定化后的果糖基轉(zhuǎn)移酶最適催化溫度較游離果糖基轉(zhuǎn)移酶降低5℃。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活在除了55℃之外的其他溫度下均高于游離果糖基轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)溫度越偏離各自的最適溫度時，其相對酶活就越低。游離果糖基轉(zhuǎn)移酶對溫度的變化非常敏感，其相對酶活隨溫度變化的幅度較大；而固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活整體變化幅度則小于游離酶。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活在研究的各個溫度下均維持在70%以上；而游離果糖基轉(zhuǎn)移酶在40℃、45℃、65℃時的相對酶活則已經(jīng)低于40%。

2.2 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性

從圖2可知，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶在30～55℃溫度區(qū)間的相對酶活均維持在80%以上，到60℃時其相對酶活才大幅下降。游離果糖基轉(zhuǎn)移酶在環(huán)境溫度稍偏高一點(diǎn)時其相對酶活就開始快速下降，45℃時的相對酶活已經(jīng)低于50%，在55℃及以上幾乎失去活性。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶可能是由于自身載體的保護(hù)作用，使其活性損失明顯小于游離果糖基轉(zhuǎn)移酶，對熱變性作用不敏感，熱穩(wěn)定性增加。

2.3 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)pH

從圖3可知，游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)pH值分別為5.5和5.0，各自的相對酶活達(dá)到最大，經(jīng)固定化后的果糖基轉(zhuǎn)移酶最適反應(yīng)pH值較游離果糖基轉(zhuǎn)移酶降低了0.5。當(dāng)環(huán)境pH越偏離各自的最適pH值時，其各自的相對酶活就越低。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活在除了pH 5.5之外的其他pH值下均高于游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活隨pH變化的幅度不大，這是由于固定化載體海藻酸鈉包埋的作用，影響了酶的活性部位。游離果糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 5.5以下的相對酶活受pH影響較大，在pH 5.5～7.0區(qū)間變化幅度較小。游離果糖基轉(zhuǎn)移酶對酸性較強(qiáng)的環(huán)境非常敏感，當(dāng)pH值為5.0及以下時，游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活均低于50%。

2.4 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性

從圖4可知，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活在除了pH 3.0之外的其他pH值下均維持在70%以上，而游離果糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 8.0時的相對酶活低于50%。與游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對活性相比，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對酶活整體變化幅度不大，即固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶在pH變化范圍內(nèi)能夠保持相對較高的酶活，相比游離果糖基轉(zhuǎn)移酶具有較好的適應(yīng)性。這可能是由于載體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用，影響了固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性部位，對pH變性作用不敏感，pH穩(wěn)定性增加。

2.5 果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化動力學(xué)

利用LineweaverBurk作圖法以1/V對1/[S]作圖，按照直線在橫軸上的截距（-1/Km）求米氏常數(shù)Km，得到圖5、圖6的雙倒數(shù)圖。游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的米氏方程為：y=0.115x+0.0845（y代表1/V，x代表1/[S]，下同），固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的米氏方程為：y=0.0105x+0.4219。結(jié)合米氏方程，由圖5、圖6可知游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)Km值分別為1.36、0.03 mg·mL-1。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)遠(yuǎn)小于游離果糖基轉(zhuǎn)移酶，說明固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶對蔗糖底物更具有親和性，這可能是由于海藻酸鈉的凝膠網(wǎng)絡(luò)與果糖基轉(zhuǎn)移酶分子間物理或化學(xué)反應(yīng)作用。

2.6 固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的應(yīng)用

由圖7可知，低聚果糖的產(chǎn)率隨著固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化時間的延長呈持續(xù)增加的趨勢。在催化反應(yīng)最開始的0～4 h期間增加得最快，第4 h的低聚果糖產(chǎn)率為21.66%。第4 h僅用整個催化反應(yīng)時間的1/6，就已達(dá)到最終低聚果糖產(chǎn)率的45%。在催化反應(yīng)進(jìn)行到第16 h后，低聚果糖產(chǎn)率的增加幅度逐漸趨于平緩，除了底物減少和有害代謝物積累的原因之外，還與產(chǎn)物的反饋抑制有關(guān)。低聚果糖的產(chǎn)率在催化反應(yīng)結(jié)束的第24 h達(dá)到最大，為48.03%。

從低聚果糖合成液的HPLC色譜圖（圖8）可知，在反應(yīng)時間13 min和19 min分別出現(xiàn)了蔗果三糖和蔗果四糖的峰，在反應(yīng)時間6 min和8 min分別出現(xiàn)了葡萄糖和蔗糖的峰。進(jìn)一步證實固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)及低聚果糖產(chǎn)率受到了副產(chǎn)物葡萄糖的抑制，且殘存未反應(yīng)完的蔗糖。葡萄糖和蔗糖均能使人體血糖升高，這會導(dǎo)致糖尿病等患者無法使用該產(chǎn)品，降低了產(chǎn)品的功能特性，所以去除葡萄糖是提升低聚果糖產(chǎn)率的關(guān)鍵。

3 討論與結(jié)論

本研究采用海藻酸鈉包埋法制備固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，研究其催化特性及其合成FOS的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，海藻酸鈉固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適催化溫度為50℃，pH值為5.0，酶學(xué)動力學(xué)米氏常數(shù)Km值為0.03 mg·mL-1。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶在55℃及以下能保持較高的酶活，到60℃時酶活大幅下降，在pH 3.0～8.0區(qū)間內(nèi)均能保持較高的酶活。采用該固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶以蔗糖為底物可制得48.03%純度的低聚果糖。

固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶相對于游離果糖基轉(zhuǎn)移酶具備更好的與蔗糖底物的親和性、更好的溫度及pH穩(wěn)定性等優(yōu)良特性，主要原因是其固定化載體的結(jié)構(gòu)和功能在發(fā)揮作用，在一定程度上能夠抵擋不利的外界環(huán)境，保護(hù)里面的酶分子，且不會阻礙其發(fā)揮催化功能。但在儲存和應(yīng)用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶時依然要注意環(huán)境條件，尤其要避免高溫環(huán)境，否則酶容易失活。經(jīng)海藻酸鈉固定化后的果糖基轉(zhuǎn)移酶在連續(xù)催化反應(yīng)過程中沒有出現(xiàn)明顯的破碎脫落現(xiàn)象，表明其固定化載體的結(jié)構(gòu)具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，進(jìn)而說明該固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶可以重復(fù)使用。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的反應(yīng)進(jìn)行到后期時，反應(yīng)速率明顯減緩，低聚果糖產(chǎn)率的增幅越來越少。其中副產(chǎn)物葡萄糖是抑制催化反應(yīng)的重要因素。隨著催化反應(yīng)時間的增加，葡萄糖逐漸累積，低聚果糖產(chǎn)率的增加也越發(fā)困難。無論是游離酶還是固定化酶，其催化反應(yīng)均會受到葡萄糖的抑制。葡萄糖的存在不僅抑制著催化反應(yīng)的進(jìn)行、抑制產(chǎn)物低聚果糖的產(chǎn)量，還會降低產(chǎn)品的功能特性，限制產(chǎn)品的推廣。目前市場上大多數(shù)產(chǎn)品的低聚果糖含量僅50%～60%，只有少數(shù)產(chǎn)品能達(dá)到90%以上。已有研究人員考慮加入葡萄糖氧化酶（GOD）將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和H2O2（葡萄糖+O2

GOD 葡萄糖酸+H2O2），但H2O2能使GOD失活，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此還需添加過氧化氫酶（CAT）來消除H2O2，葡萄糖酸則通過離子交換或與鈣結(jié)合形成葡萄糖酸鈣除去[9-11]。通過GOD和CAT的協(xié)同作用能大量消除葡萄糖，增加低聚果糖的產(chǎn)率，但酶的價格較昂貴。也有利用葡萄糖異構(gòu)酶（GI），但效果不理想，不能有效降低體系中葡萄糖的含量[12-13]。此外，研究人員還利用酵母等微生物選擇性消化葡萄糖且不會降解低聚果糖，將葡萄糖發(fā)酵代謝成乙醇等物質(zhì)[14]。本研究對固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成低聚果糖的過程中如何消除葡萄糖的影響并未進(jìn)行相關(guān)探索，下一步將繼續(xù)深入研究，以進(jìn)一步提高低聚果糖產(chǎn)率，為加快低聚果糖產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]SINGH S P，JADAUN J S，NARNOLIYA L K，et al.Prebiotic Oligosaccharides：Special Focus on Fructooligosaccharides，Its Biosynthesis and Bioactivity[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2017，183（2）：613-635.

[2]GOH Y J，KLAENHAMMER T R.Genetic mechanisms of prebiotic oligosaccharide metabolism in probiotic microbes[J].Annual Review of Food Science and Technology，2015，6（1）：137-156.

[3]OJWACH J，ADETUNJI A I，MUTANDA T，et al.Oligosaccharides production from coprophilous fungi：An emerging functional food with potential healthpromoting properties[J].Biotechnology Reports，2022，33（6）：e00702.

[4]ZHANG N，JIN M，WANG K，et al.Functional oligosaccharide fermentation in the gut：Improving intestinal health and its determinant factorsA review[J].Carbohydrate Polymers，2022，284（12）：119043.

[5]MUTANDA T，MOKOENA M P，OLANIRAN A O，et al.Microbial enzymatic production and applications of shortchain fructooligosaccharides and inulooligosaccharides： recent advances and current perspectives[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2014，41（6）：893-906.

[6]李元.黑曲霉生物轉(zhuǎn)化甘蔗糖蜜生產(chǎn)低聚果糖研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2022.

[7]李成林.短梗霉菌發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2021.

[8]陳又銘，李寧，袁衛(wèi)濤，等.低聚果糖的功能性質(zhì)及其在食品中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑，2022，33（1）：11-15.

[9]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 低聚果糖：GB/T 23528-2009[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[10]NOBRE C，SIMES L，GONALVES D，et al.Fructooligosaccharides production and the health benefits of prebiotics[J].Current Developments in Biotechnology and Bioengineering，2022，109-138.

[11]KOVCS Z，BENJAMINS E，GRAU K，et al.Recent developments in manufacturing oligosaccharides with prebiotic functions[J].Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，2014，143：257-295.

[12]MARTINS G N，URETA M M，TYMCZYSZYN E E，et al.Technological Aspects of the Production of Fructo and GalactoOligosaccharides.Enzymatic Synthesis and Hydrolysis[J].Frontiers in Nutrition，2019（6）：78.

[13]王雪.果糖基轉(zhuǎn)移酶及低聚果糖生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2009（5）：45-48.

[14]郁蓉，王歲樓. 酶法制備功能性低聚糖的研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng)，2009（12）：32-35.

（責(zé)任編輯：林玲娜）