雙氫青蒿素對腦膠質瘤小鼠表皮生長因子（EGF）和血管內皮生長因子（VEGF）的影響

詹增欽，劉 穎，鄭鐘洪，李景濤，伍 鑫

（廣州中醫藥大學金沙洲醫院國際腫瘤醫療中心，廣東 廣州 510000）

膠質瘤是最常見的顱內腫瘤之一，該病在全球發病率為3 ～6.4/10 萬[1]。目前，膠質瘤的診療方式除了手術、傳統的放化療外，還有根據分子病理的靶向治療、腫瘤電場治療，但決定治療方式的因素除了膠質瘤生長的位置，也與潛在的腫瘤生物學有關[2]。因膠質瘤呈彌漫性浸潤，中樞神經系統具有敏感性，傳統治療會導致一系列的神經損傷，導致患者預后生活質量往往較差，易復發，生存期短。根據世界衛生組織(WHO) 制定的中樞神經系統腫瘤的分類[3]，Ⅰ級和Ⅱ級膠質瘤為低級別膠質瘤(LGG)，Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤為高級別膠質瘤，其中以膠質母細胞瘤為主(GBM)。盡管對于GBM 臨床上有多模式的治療策略，但此病患者的預后通常不佳，其中位生存時間僅為12 ～14個月，5 年內生存率僅為5%[4]。因此，深入研究膠質瘤的發病機制，探索潛在的治療靶點與藥物對相關診斷和治療至關重要。青蒿素的水溶性較差，不易揮發，生物利用度偏低，這限制了其臨床應用，因此研究人員通過結構改造合成了低毒、安全的青蒿素衍生物——雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）[5]。有研究表明，DHA 對宮頸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤以及前列腺癌等惡性腫瘤有明顯的抑制作用，國內亦有少量文獻[6]闡述了DHA 與腦膠質瘤的發生存在一定聯系。表皮生長因子（EGF）是由53 個氨基酸殘基組成的，與細胞的分化、增殖及癌變關系密切[7]。通過結合表皮生長因子受體可以抑制上皮增殖，促進組織修復，且具有保護細胞的作用。一旦EGF過度表達，會引起細胞過度增生、變異，從而發生向惡性表型的轉化[7]。血管內皮生長因子（VEGF）是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可促進血管內皮細胞增殖和新生血管的生成。研究表明，在各級別腦膠質瘤患者群體中，VEGF 的表達均與疾病的嚴重程度密切相關，提示VEGF 的異常表達在腦膠質瘤惡化的轉變過程中發揮著重要作用[8]。DHA 同時也介導著VEGF 的表達，但對于DHA 是否能通過改變EGF 和VEGF 的表達來控制腦膠質瘤的發展，尚無相關研究報道，且鮮有相關的動物實驗。在本文中，筆者主要是觀察DHA 對腦膠質瘤小鼠EGF 和VEGF 表達情況的影響，旨在為抗腫瘤新藥物的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

購買8 周齡SPF 級SD 小鼠24 只，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心〔生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002〕，體重在18 ～22 g 之間。實驗中所有處理方法均經過倫理委員會批準。

1.2 方法

（1）實驗分組：動物實驗前喂養1 周，飼養箱溫度(24±1)℃，濕度（50±5）%，明暗各12 h（8 am—8 pm）, 自由進食及飲水，隨機分為正常組、模型組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組各6 只。（2）模型構建：除正常組以外，其余組參考相關文獻造模，將裸鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，頭皮逐層切開暴露，用2 mL 注射器針頭在前囟前1.0 mm、中線旁開2.5 mm、硬腦膜下3.5 mm 處鉆孔。用微量注射器吸取10 μL（1×105個細胞）配制好的C6 膠質瘤干細胞懸液，緩慢注射于小鼠紋狀體內，注射后停留10 min。造模7 天后，動物活體成像儀檢測裸鼠腫瘤熒光量達1×105時，認為造模成功。（3）干預方式：各組小鼠自由進食，雙氫青蒿素低劑量組給予25 mg/kg雙氫青蒿素灌胃，雙氫青蒿素高劑量組給予50 mg/kg雙氫青蒿素灌胃，模型組同時灌胃等量生理鹽水，正常組不做任何處理，每天1 次，持續15 天。（4）檢測方法：實驗結束后，處死小鼠，取腦膠質瘤組織（正常組取正常腦組織），用電子天平稱取0.5 g 腦膠質瘤組織（正常組取正常腦組織），用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，加入9 倍量的冰生理鹽水，用勻漿器制成10%的組織勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)。以3500 r/min 離心15 min，取上清液置4℃冰箱保存，按小鼠EGF、VEGF ELISA 試劑盒說明書要求在酶聯免疫檢測儀上檢測EGF、VEGF 的含量，具體的檢測方式如下：將各種試劑于室溫下平衡30 min，每孔加樣100 μL，蓋上板膜，37℃孵育2 h，棄去液體，甩干；每孔加入生物素標記的抗體工作液100 μL，蓋上板膜，37℃孵育1 h，棄去液體，甩干；洗板3 次，每次浸泡2 min，每孔加200 μL 洗液；每孔加HRP 標記的親和素工作液100 μL，蓋上板膜，37℃孵育1 h，棄去液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡2 min，每孔加200 μL 洗液；每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15 ～30 min；每孔加入終止液50 μL，終止反應；反應終止后5 min 內用酶標儀在450 nm 波長處測量吸光度OD 值。

1.3 統計學處理

2 結果

通過ELISA 試劑盒檢測各組小鼠的EGF 和VEGF水平，驗證了雙氫青蒿素能夠改變腦膠質瘤模型小鼠組織EGF、VEGF 的水平（使其趨于正常），具體的結果如下（表1 所示）：正常組、模型組、雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠腦膠質瘤組織EGF 值分別 為（235.87±21.72）pmol/L、（584.36±29.63）pmol/L、（347.34±31.99）pmol/L 和（305.61±28.14）pmol/L。上述各組小鼠的腦膠質瘤組織VEGF 值則分別為（37.12±2.21）ng/L、（72.88±6.67）ng/L、（55.40±5.54）ng/L 和（42.81±3.39）ng/L。與正常組對比，模型組小鼠的EGF 和VEGF 水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，雙氫青蒿素低劑量組的EGF 和VEGF 水平均明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，雙氫青蒿素高劑量組的EGF 和VEGF 水平也均明顯下降（P＜0.01），并且下降幅度比雙氫青蒿素低劑量組的下降幅度更大，更加接近于正常小鼠的EGF 和VEGF 水平。提示了雙氫青蒿素可以抑制腦膠質瘤小鼠模型異常增長的EGF 和VEGF 水平，使其恢復至正常的狀態，并且這種抑制效果和雙氫青蒿素的濃度呈正相關。

表1 各組小鼠EGF 和VEGF 的比較（± s）

表1 各組小鼠EGF 和VEGF 的比較（± s）

注：EGF，表皮生長因子；VEGF，血管內皮生長因子；* 與正常組比較，P＜0.01；#與模型組比較，P ＜0.01；△與雙氫青蒿素低劑量組比較，P ＜0.01。

組別 只數 EGF(pmol/L) VEGF(ng/L)正常組 6 235.87±21.72 37.12±2.21模型組 6 584.36±29.63* 72.88±6.66*雙氫青蒿素低劑量組 6 347.34±31.99*# 55.40±5.54*#雙氫青蒿素高劑量組 6 305.61±28.14*#△ 42.81±3.39*#△F 值 173.30 65.86 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

青蒿素因其在治療瘧疾中的重要作用而聞名于世。除了抗瘧疾的特性，人們發現青蒿素及其衍生物還具有多種藥物活性，如抗病毒、抗炎癥和抗腫瘤作用，同時具有多種生物活性，包括改善肝臟損傷、抑制炎癥和逆轉腫瘤細胞耐藥[9]。DHA 作為青蒿素的衍生物之一，在過去十年的研究中，一直都是抗腫瘤新藥物的研發重點[10]。其已經通過大量動物實驗被證實可抑制癌癥發生過程[11]。有研究指出，DHA 可通過激活氧化應激誘導人急性T 淋巴細胞增殖及凋亡來抑制癌變，對多種實體瘤細胞具有明顯的生長抑制作用。不僅如此，DHA 還可通過包括Wnt/β-catenins 等復雜的信號通路傳遞細胞死亡信息、抑制癌變細胞轉移和腫瘤血管生成，并可抑制促癌信號[12]。有研究指出，DHA 能夠干預EGF 和VEGF 的表達。我們的動物實驗初步證明了當給予腦膠質瘤小鼠DHA 干預時，小鼠的EGF 和VEGF 表達水平降低，并且隨著給藥濃度的增加，其表達水平趨于正常。腫瘤血管生成學說目前已得到越來越多的認可[13]。EGF 和VEGF 與腦膠質瘤的發生密切相關[8]，臨床上常將這兩者作為膠質瘤檢測的標志物。而介導EGF 和VEGF 的信號通路極其豐富，有JAK2/STAT3 信號通路、VEGF/VEGFR 信號通路、PI3K／AKT 信號轉導通路等等[14-16]。動物實驗的數據結果說明雙氫青蒿素可能通過介導某些信號通路來調控EGF、VEGF 的表達,從而影響腦膠質瘤的發展進程，然而具體的信號通路，還需進一步分析研究。

綜上所述，雙氫青蒿素對腦膠質瘤小鼠的EGF、VEGF 表達水平具有明顯的抑制效果，其作用機制可能是雙氫青蒿素通過某些信號通路來調控EGF、VEGF 的表達，進而影響了腦膠質瘤的血管生長情況。