腎活檢組織病理診斷中采用石蠟切片免疫熒光染色法的臨床價值分析

劉 茜

（貴陽康養職業大學，貴州 貴陽 550001）

近年來隨著我國人口老齡化速度的加快，各類基礎疾病的發病率均逐年增加，其中就包括腎病[1]。目前，臨床上一般是對腎組織樣本實施冰凍切片免疫熒光染色診斷或石蠟切片免疫熒光染色診斷，或將二者聯合應用。臨床一般認為冰凍切片免疫熒光染色法的診斷效果相對較佳，但也存在一定不足，如該方法對于檢測樣本的要求苛刻，在運輸、保存等環節稍有不慎就可影響最終的診斷結果（哪怕只是溫度稍高即可造成影響）[2]。另外，冰凍組織的細胞結構清晰度、完整性也欠佳，在某些情況下一個樣本可以得出多個互相矛盾的診斷結果。而石蠟切片則是臨床上為改善冰凍切片進行的一種嘗試。早期臨床認為基于福爾馬林固定的石蠟切片不適合開展免疫熒光染色，因為在固定的過程二價鈣離子與其他二價離子會影響抗原，可能使抗原無法充分暴露，導致免疫熒光特異性減弱[3]。因此，在早期石蠟切片固定并不被作為活檢的主要手段，其更多的是輔助冰凍切片方案進行更高精度的診斷，盡管研究證實兩種方案的效能相近[4]。近年來隨著針對免疫熒光染色法的進一步研究，一些新的、特殊的染色方案被提出，石蠟切片造成的免疫熒光特異性減弱的問題得以改善，理論上其可以提供更為有效的診斷效能。基于此，本研究以2021 年1 月至2022 年12 月進行病理學腎組織活檢的83 例患者為研究對象，探討腎活檢組織病理診斷中應用新式石蠟切片免疫熒光染色法的可行性與效能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究開展的時間為2021 年1 月至2022 年12 月，共納入83 份腎組織樣本，其中10 份來源于貴州電力醫院，73 份來源于貴州醫科大學附屬醫院。對全部樣本均實施常規冰凍切片免疫熒光染色診斷與新式石蠟切片免疫熒光染色診斷，將前者列為冰凍組，將后者列為石蠟組。83 份腎組織樣本來源于83 例患者，其中男51 例，女32 例，年齡范圍45 ～68 歲，均值（55.31±3.96）歲；其中膜性腎病23 例，狼瘡性腎病30 例，IgA 腎病30 例。病例納入標準：（1）臨床資料完整，并簽署知情同意書；（2）經耐受性評估符合腎穿刺活檢指征。病例排除標準：（1）存在認知功能障礙或合并精神疾病；（2）合并嚴重感染，或伴有其他置管支持治療措施，如維持性血液透析；（3）存在嚴重的肝、腎功能障礙；（4）不耐受腎穿刺活檢或拒絕行腎穿刺活檢。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片免疫熒光染色 對腎組織進行OCT 包埋，然后采用冰凍切片機切片，厚度為5 μm，干燥3 min 后保存。轉移至實驗室，在標本中加入異硫氰酸熒光素標記的兔抗人作為一抗，包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）及補體C3、補體C1q。將切片置于濕盒內，在37 ℃的恒溫水浴鍋中孵育45 ～60 min。用磷酸鹽緩沖液浸洗5 min，反復浸洗3 次，最后直接進行熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 石蠟切片免疫熒光染色 對腎組織進行常規處理后使用3- 氨丙基-3- 乙氧基甲硅烷處理，預防脫片。脫蠟至水（2 次，單次20 min）后實施抗原修復，使用酸堿度為6.0 的檸檬酸為緩沖液，行微波加熱修復，冷卻為室溫后實施胰酶消化。置于37 ℃的恒溫水鍋內消化15 min，然后配置六胺銀染色，材料為：50 mL硼砂溶液+ 六次甲基四胺銀粉劑。染色：將溶液放置于62 ℃溫水箱中預熱，將石蠟樣本放入62 ℃六胺銀中30 min，持續恒溫下切片，出現黑色反應后撈出。采用蒸餾水沖洗，以硫代硫酸鈉溶液處理3 min 后沖洗，采用Mayer 蘇木素染液（上海虹橋試劑）染色5 min，沖洗3 min 后行脫水處理。以伊紅染液（上海虹橋試劑）染色1 min，梯度酒精脫水，以二甲苯（天津市化學試劑供銷公司）為透明劑，用中性樹膠封固，后觀察確認IgA、IgG、IgM 及補體C3、補體C1q 的陽性情況。

1.3 觀察指標

觀察并統計兩種診斷方式對膜性腎病、狼瘡性腎病、IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補體C3、補體C1q 的陽性檢出情況。

1.4 統計學方法

2 結果

腎病理組織活檢的陽性檢出結果顯示，石蠟組23 例膜性腎病患者、30 例狼瘡性腎病患者和30 例IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補體C3、補體C1q 的陽性檢出率均高于冰凍組，但兩組僅在膜性腎病患者IgA、狼瘡性腎病患者IgA、IgG、補體C1q 的檢出率方面存在統計學差異（P＜0.05），其他組間對比均無統計學差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1 兩種診斷方式診斷結果的比較[例（%）]

3 討論

腎病在臨床上的發生率較高，且此類疾病的診治較為復雜，有超過半數的患者病情會持續進展[5]。這就需要臨床準確判斷腎病患者的疾病類型，以及其免疫反應的情況，實現明確診斷，以便及早開展針對性治療，延緩患者病情的發展。由于腎病主要是腎小球、腎微血管及其他細微組織受損，因此影像學診斷的效果較差。此外，腎功能損傷又是一個緩慢的過程，因此早期通過生化標志物檢測進行診斷的效果也一般?；诖?，病理學診斷成為當下腎病最為準確的診斷方案。但由于腎組織的特殊性，加之其主要是通過觀察免疫球蛋白等物質來進行疾病類型的鑒別與嚴重程度的判斷，以及當下較為常用的冰凍切片免疫熒光染色法本身存在的缺陷，導致實際應用過程中病理學診斷仍然存在一定的不足[6]。石蠟切片免疫熒光染色法并不是針對腎活檢病理學診斷的新方案，其發明已有較長時間，但臨床認為石蠟固定樣本會造成抗原封閉的問題，因此存在一定的局限性。近年來隨著抗原修復技術的發展，已逐漸解決了石蠟固定導致抗原封閉的不足。目前，臨床上常用的抗原修復方案包括微波、高壓等，效果均較佳。另一問題是，石蠟固定會造成切片的非特異性熒光染色存在缺陷，易出現背景染色的現象，這是因為目前對于石蠟脫蠟的時間沒有定論。但隨著大量實驗的開展，逐漸發現二次脫蠟以及20 min 左右的脫蠟時間較為理想，同時新式染色法也彌補了染色缺陷、背景染色的問題。得益于石蠟切片可以很好地保存組織結構，使其呈現較高的清晰度，因此理論上新式石蠟切片免疫熒光染色法的效能應該優于一般冰凍切片免疫熒光染色法。本研究結果顯示，石蠟組23 例膜性腎病患者、30 例狼瘡性腎病患者和30 例IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補體C3、補體C1q 的陽性檢出率均高于冰凍組，但兩組僅在膜性腎病患者IgA、狼瘡性腎病患者IgA、IgG、補體C1q 的檢出率方面存在統計學差異（P＜0.05），其他組間對比均無統計學差異（P＞0.05）。該結果符合上述觀點。筆者猜測導致該結果出現的原因主要有兩點：一是行腎組織穿刺活檢時，為了減輕損傷，一般只會采集較小的樣本，傳統冰凍切片免疫熒光染色法受制于各種因素的影響，只能觀察一個或幾個腎小球，并不能很好地判斷腎組織的具體情況，且冰凍切片必須在穿刺后的一定時間內完成，否則樣本就會發生自溶，實際上處理樣本的時間可能不足；二是新式石蠟切片免疫熒光染色法可以觀察腎小球系膜區域，了解基膜的變化，理論上觀察范圍與角度均大于傳統冰凍切片免疫熒光染色法，另外石蠟切片可以很好地保存組織結構，降低觀察的難度，提高觀察的準確性。

綜上所述，在腎病患者腎組織病理活檢診斷中，新式石蠟切片免疫熒光染色法的診斷效能優于傳統冰凍切片免疫熒光染色法，有助于更為準確地檢出不同類型的腎病，具有較高的臨床應用價值。