不同輔料炮制對鐮形棘豆抗炎與毒性作用的影響?

黃聰琳，郭 敏，李曉東，王曉琳，邢福軍，柳淵潔

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050； 2 甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050

鐮形棘豆為豆科棘豆屬多年生草本植物，收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準（藏藥）》第一冊，根及根莖或全草入藥。鐮形棘豆抗炎作用顯著，為藏醫“三大抗炎藥”之一［1］。但其“毒性”問題也頗受爭議。鐮形棘豆性寒味辛，具小毒。動物長期或大量采食鐮形棘豆會引發中毒、流產、致畸等毒性反應［2］，導致其臨床藥用安全性受到質疑。

中藥炮制可存效減毒，炮制后的中藥飲片可安全用于臨床。對鐮形棘豆的炮制，尚未見文獻報道。研究表明，鐮形棘豆的主要成分為黃酮類、生物堿類、多糖類、揮發油及皂苷等，其中，黃酮類化合物的生物學活性最為廣泛，是發揮抗炎作用的主要成分，生物堿是該植物毒性活性的主要成分［3-4］。本研究利用不同輔料對鐮形棘豆藥材進行炮制，比較鐮形棘豆生品和不同炮制品的總黃酮和總生物堿含量的差異及抗炎效果與毒性作用差異。

1 儀器與試藥

1.1 試藥及試劑藏藥鐮形棘豆（產地：甘肅），藥材經甘肅省藥品檢驗研究院鑒定認可；蘆丁標準品（CAS：569-92-6）購自中國食品藥品檢定研究院；野決明堿對照品（CAS：529-78-2）購自上海源葉生物科技有限公司。龍眼井9度米醋（陜西晉中懷仁榮欣釀造廠）；老閘六年花雕酒（紹興三江酒廠）；純牛奶（蒙牛乳業）；阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥保健有限公司，批準文號：國藥準字J20171021，規格：100 mg/片）；谷草轉氨酶（aspartate transminase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CRE）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）生化測定試劑盒（長春匯力生物技術有限公司）；甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙酸、磷酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、三氯甲烷、石油醚等試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器DHG-9055 型電熱恒溫鼓風干燥箱（齊欣，上海）；UV2450 型紫外分光光度計（島津，日本）；BSA224S 型電子分析天平（賽多利斯，德國）；DFY-600C型萬能高速粉碎機（谷寧，上海）；Allegra 64R 型高速低溫離心機（貝克曼，美國）；Chemray 420型全自動生化分析儀（雷杜，深圳）。

1.3 實驗方法

1.3.1 生品及炮制品制備生品 鐮形棘豆藥材除去雜質和殘莖，切成3 cm小段，即可。醋制：鐮形棘豆凈制后，加入適量米醋拌勻，悶潤12 h，放入60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱，干燥備用。酒制：鐮形棘豆凈制后，加入適量黃酒拌勻，悶潤12 h，放入60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱，干燥備用。奶制：鐮形棘豆凈制后，加入適量牛奶拌勻，置4 ℃冰箱悶潤12 h，放入60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱，干燥備用。

1.3.2 總黃酮提取 將干燥的鐮形棘豆粉碎，過80 目篩。準確稱取鐮形棘豆藥材粉末2.0 g，置100 mL 圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，回流提取2 次，每次1 h，放冷，再稱定質量，加70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過。

1.3.3 總黃酮含量測定

1.3.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品7.15 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL 量瓶中，即得0.286 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.3.3.2 標準曲線的制備 分別精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，按紫外-可見分光光度法，于510 nm 處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，對照品濃度（mg/mL）（X）為橫坐標，計算回歸方程得：Y=12.519X+0.0126，r=0.9992。在0.011 44～0.068 64 mg/mL范圍內，線性良好。

1.3.3.3 鐮形棘豆 總黃酮含量測定分別精密量取生品及各炮制品總黃酮提取液各3 mL 至25 mL 的容量瓶中，加水至6 mL，按照“1.3.3.2”項方法進行處理，于510 nm 處測定吸光度，并計算鐮形棘豆總黃酮的含量。

1.3.4 總生物堿提取 準確稱取鐮形棘豆藥材粉末2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入2.5%的乙酸20 mL，稱質量，超聲提取1 h，放冷，再稱定質量，加2.5%的乙酸補足減失質量，濾過，濾液用1 mol/L的NaOH堿化至pH 10.0，石油醚振搖提取3 次，每次20 mL，堿水溶液繼續用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，取三氯甲烷濃縮，以甲醇定容至5 mL量瓶中。

1.3.5 總生物堿含量測定[7]

1.3.5.1 標準曲線的制備 分別精密量取野決明堿對照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL，揮干甲醇，用少量三氯甲烷溶解，置分液漏斗中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH=5.4）5.0 mL，0.05%溴麝香草酚藍溶液2.0 mL，搖勻，以三氯甲烷8 mL振搖提取，靜置2 h 后，取三氯甲烷層，于413 nm處檢測吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，對照品進樣量（μg）（X）為橫坐標，計算回歸方程得：Y=0.0098X+0.0125，r=0.9993。野決明堿進樣量在16.5～82.5 μg范圍內，線性良好。

1.3.5.2 鐮形棘豆藥材 總生物堿含量測定分別精密量取生品及各炮制品總生物堿提取液各1 mL，揮干甲醇，按照“1.3.5.1”項處理，于波長413 nm處測定吸光度，并計算鐮形棘豆總生物堿的含量。

1.3.6 中藥藥液制備 分別稱取鐮形棘豆生品及醋制品、酒制品、奶制品適量，置不銹鋼鍋內，加入20 倍量蒸餾水（w∶v=1∶20），浸泡0.5 h，130 ℃煎煮1 h后，過濾，收集濾液。殘渣加入15倍量蒸餾水（w∶v=1∶15），130 ℃煎煮0.5 h 后，過濾。合并兩次濾液并濃縮至所需濃度，冷藏備用。

1.3.7 抗炎實驗

1.3.7.1 小鼠分組及給藥 昆明種小鼠60 只，雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組、生品組、醋制品組、酒制品組、奶制品組和陽性對照組（阿司匹林腸溶片）。每組10 只，連續灌胃給藥7 天，每日1 次。鐮形棘豆給藥組給藥劑量為1.5 g/kg（以生藥計），給藥體積為20 mL/kg；陽性對照組治療阿司匹林，0.2 g/kg；空白對照組給予等體積蒸餾水。給藥期間小鼠自由飲水進食。

1.3.7.2 醋酸扭體實驗 于末次給藥30 min后，每只小鼠腹腔注射1.0 %冰醋酸溶液10 mL/kg，5 min 后記錄15 min 內的扭體反應次數，并計算藥物對扭體反應的抑制率。

扭體抑制率（%）=（空白對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數）/空白對照組平均扭體次數×100%

1.3.7.3 二甲苯致炎小鼠 耳腫脹實驗末次給藥30 min后于小鼠右耳正反兩側均勻涂抹二甲苯50 μL，左耳作對照，致炎1 h后脫頸椎處死，于左右耳同一部位用直徑7 mm 的打孔器打下耳片，用電子天平稱耳片重，以兩耳片質量差為腫脹度，計算出腫脹度及耳腫脹抑制率。

腫脹度=右耳耳片質量-左耳耳片質量

腫脹抑制率（%）=（對照組腫脹度-給藥組腫脹度）/對照組腫脹度×100%

1.3.8 毒性實驗

1.3.8.1 毒性實驗預實驗 昆明種小鼠50 只，雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組、生品組、醋制品組、酒制品組、奶制品組，每組10只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水、給藥組給予15 g/kg（以生藥計）劑量藥液單次灌胃，給藥體積為20 mL/kg，密切觀察8 h 內反應，并連續觀察14 天。記錄各動物的中毒表現（如外觀、行為、飲食、排泄物等）、毒性反應出現及恢復時間以及死亡情況等。實驗期間無動物死亡，給藥組及空白對照組動物均未見明顯中毒表現，體質量均呈增長趨勢，給藥組與同期空白對照組無顯著差異。

1.3.8.2 14 天毒性實驗 昆明種小鼠50 只，雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組、生品組、醋制品組、酒制品組、奶制品組，每組10只。連續灌胃給藥14天，每天1次，給藥劑量為15 g/kg（以生藥計），給藥體積為20 mL/kg，空白對照組給予等體積蒸餾水，于末次給藥后12 h小鼠禁食禁水，24 h摘眼球采血，血樣室溫靜置2 h后，離心半徑：10 cm，3000 r/min 離心15 min，分離血清，用于血清生化指標AST、ALT、BUN、CRE 和LDH 的檢測。迅速取肝、腎組織，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，稱定質量，用于計算臟器比；肝、腎組織迅速固定于組織固定液中，用于制作組織切片。組織切片HE 染色由武漢塞維爾生物有限公司制作完成。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0 統計學軟件分析實驗數據，計量資料符合正態分布以±s 表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，方差齊性實驗數據采用LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鐮形棘豆生品及各炮制品總黃酮含量鐮形棘豆經過炮制，除醋制品外，總黃酮含量均有所升高，生品與各炮制品總黃酮含量由高到低依次為：奶制品＞酒制品＞生品＞醋制品。見表1。

表1 鐮形棘豆不同制品中總黃酮及生物堿平均含量比較（±s） mg/g

表1 鐮形棘豆不同制品中總黃酮及生物堿平均含量比較（±s） mg/g

樣品生品醋制品總黃酮平均含量20.78±0.13 20.13±0.15生物堿平均含量0.090±0.0013 0.086±0.0012生物堿平均含量0.103±0.0014 0.091±0.0004樣品酒制品奶制品總黃酮平均含量21.72±0.12 24.01±0.17

2.2 鐮形棘豆生品及各炮制品總生物堿含量鐮形棘豆經過炮制，總生物堿含量均有所降低，其中奶制品降低更為明顯?？偵飰A含量由高到低依次為：生品＞醋制品＞酒制品>奶制品。見表1。

2.3 醋酸扭體反應鐮形棘豆各組和陽性對照組小鼠扭體次數均明顯減少，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；扭體反應抑制率由高到低排序依次為：陽性對照（阿司匹林）＞奶制品＞酒制品＞生品＞醋制品。見表2。

表2 各組小鼠醋酸致扭體反應及二甲苯致耳腫脹實驗比較（±s）

表2 各組小鼠醋酸致扭體反應及二甲苯致耳腫脹實驗比較（±s）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示無數值

組別空白對照組生品組醋制品組酒制品組奶制品組陽性對照組鼠數10 10 10 10 10 10醋酸致扭體實驗15 min內扭體次數（次）31.4±7.2 24.9±5.7*25.8±3.5*23.5±5.2**21.5±5.3**20.2±5.9**腫脹抑制率（%）-36.97 28.59 33.59 34.01 44.01扭體抑制率（%）-20.7 17.8 25.2 31.5 35.7二甲苯致耳腫脹實驗二甲苯劑量（g/kg）-1.6 1.6 1.6 1.6 0.2腫脹度（mg）14.20±5.30 8.95±3.44**10.14±3.83*9.43±2.97*9.37±5.61*7.95±4.32**

2.4 二甲苯致耳腫脹實驗結果鐮形棘豆各組和陽性對照組小鼠耳腫脹度均明顯減少，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；腫脹抑制率由高到低排序依次為：陽性對照（阿司匹林）＞生品＞奶制品＞酒制品＞醋制品。見表2。

2.5 小鼠體質量，肝、腎臟器指標鐮形棘豆給藥組肝臟指數、腎臟指數均稍有升高。其中，肝臟指數升高奶制品＜酒制品＜生品＜醋制品，腎臟指數除生品升高較為明顯外，其余炮制品幾乎與空白對照組無差異，各組數據差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠體質量與肝、腎臟器指標比較（±s）

表3 各組小鼠體質量與肝、腎臟器指標比較（±s）

組別空白對照組生品組醋制品組酒制品組奶制品組鼠數10 10 10 10 10體質量（g）31.01±3.87 32.68±1.97 31.42±3.74 31.74±2.88 31.51±3.20腎臟指數（%）1.15±0.12 1.22±0.22 1.15±0.17 1.18±0.14 1.16±0.14肝重（g）1.28±0.18 1.43±0.17 1.42±0.24 1.36±0.29 1.31±0.27肝臟指數（%）4.13±0.25 4.35±0.29 4.53±0.64 4.24±0.64 4.13±0.55腎重（g）0.36±0.06 0.40±0.08 0.37±0.09 0.38±0.07 0.37±0.08

2.6 血液生化指標與正常對照組比較，鐮形棘豆各給藥組均能引起AST、ALT的顯著升高（P＜0.01）。與鐮形棘豆生品組比較，炮制品可降低AST、ALT水平，其中酒制品、奶制品降低AST 水平具有顯著性差異（P＜0.05）。鐮形棘豆生品引起小鼠血清LDH、BUN水平升高，而各炮制品BUN、LDH水平有所降低。鐮形棘豆各給藥組均能引起小鼠血清CRE的升高，生品組CRE 升高顯著（P＜0.01），炮制品CRE 升高不顯著。與生品組比較，各炮制品組的CRE 水平降低，其中酒制品、奶制品水平降低有顯著性差異（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清生化指標比較（±s）

表4 各組小鼠血清生化指標比較（±s）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與生品組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

組別空白對照組生品組醋制品組酒制品組奶制品組CRE（U/L））33.00±6.66##41.78±6.92**38.67±8.03 34.87±6.25#33.91±7.58#鼠數10 10 10 10 10 AST（U/L）124.12±25.95##223.26±23.81**203.64±43.45**187.93±28.88**#194.42±44.82**#ALT（U/L））49.50±6.75##69.36±11.28**65.18±6.74**64.86±13.55**64.77±7.93**LDHU/L））1101.02±217.28 1236.88±160.07 1059.72±178.63#980.99±160.00##946.82±127.88##BUN（mmol/L）8.23±1.40 8.50±0.92 7.76±1.35 7.76±1.03 7.49±0.86

2.7 病理組織學觀察空白對照組小鼠肝索排列規律，肝小葉結構完整。鐮形棘豆生藥組肝索結構不清楚，肝臟細胞體積變大，大小不一致，出現氣球樣變，肝血竇增寬。與生藥組相比，各炮制組小鼠肝臟病變范圍減小，細胞炎癥反應減輕。空白對照組小鼠腎臟組織結構基本正常，無明顯病理變化。鐮形棘豆生藥組腎小管上皮細胞可見輕微空泡變性，腎小球萎縮，分界不清，各炮制組腎臟組織變性程度略有減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝、腎組織病理學組織圖（HE，×200）

3 結論

鐮形棘豆含有多種生物活性成分，藥用價值顯著，是一種具有廣泛應用前景的藏藥［6］，但是隨著近年來中藥中毒事件的發生，其毒性也備受關注。中藥炮制技術是否能夠在不損害其藥效的前提下，降低鐮形棘豆的毒性值得探討。傳統的中藥減毒炮制多以醋、酒為主要的炮制輔料。除此以外，藏藥典籍中獨特的奶制方法，對苦馬豆素等生物堿類毒性成分也有良好的減毒作用［7］，故本研究選取了醋、酒、奶為輔料。為了突出炮制輔料的單一因素，在炮制品的制備過程中，僅炮制輔料不同，其他炮制時間、溫度、干燥方式等均相同。

研究表明，鐮形棘豆黃酮類化合物的生物學活性最為廣泛，是發揮抗炎作用的主要成分［8］。前期研究表明，鐮形棘豆總黃酮的抗炎效果優于單一黃酮成分，故以總黃酮含量作為抗炎活性的檢測指標。生物堿被認為可能是該植物毒性活性的主要成分［4，9］，具體是哪種單一成分尚無定論，故以總生物堿含量作為毒性成分的檢測指標。

鐮形棘豆經過炮制，除醋制品的總黃酮含量稍有下降外，酒制品和奶制品的總黃酮含量略有升高，其他研究也發現酒制、奶制的炮制方法可以有效提高活性成分總黃酮的含量［10］，可能與輔料滲透能夠增加黃酮類化合物的溶出度有關［11］。炮制品的總生物堿含量較之生品均有所降低，表明鐮形棘豆經過炮制可降低鐮形棘豆的毒性成分。

鐮形棘豆給藥組的扭體次數較空白對照組明顯降低，證明鐮形棘豆有良好的抗炎作用。其中，奶制品、酒制品灌胃小鼠扭體次數顯著降低，生品與醋制品次之。鐮形棘豆用藥組能夠顯著抑制小鼠的耳腫脹，生品的耳腫脹抑制率優于各炮制品，差異并無統計學意義，可能是因為除黃酮類化合物外，鐮形棘豆還存在其他具有抗炎作用的有效成分，炮制減損了其他抗炎有效成分的含量。

本研究在大劑量小鼠連續灌胃給藥14 天后發現，與空白對照組相比，鐮形棘豆生品組小鼠血清AST、ALT、LDH的水平升高，AST、ALT水平升高顯著，說明大劑量長期服用鐮形棘豆生品水煎液可能會引起肝損害。與生品組相比，各炮制品給藥組小鼠血清AST、ALT、LDH 水平降低，酒制品、奶制品AST、LDH 水平降低顯著，提示酒制品、奶制品可降低肝損害程度。鐮形棘豆生品與各炮制品總生物堿含量差異并不明顯，但生品造成的肝損傷較各炮制品有顯著差異，原因可能是中藥的肝毒性不是單一因素引起的，而是多種相互作用機制共同作用的結果［12］。與空白組對照組相比，生品組小鼠血清CRE顯著性升高，各炮制品組CRE升高不顯著。與生品組相比，各炮制品給藥組小鼠血清的CRE 水平降低，醋制品降低不顯著，酒制品、奶制品降低有顯著差異，說明鐮形棘豆炮制品對腎臟的損害低于生品。

綜上所述，本研究發現鐮形棘豆經過炮制后，均能達到“減毒存效”的目的，效果以奶制品為最優，酒制品次之。為了更加符合用藥習慣，本研究采用鐮形棘豆水提液灌胃進行小鼠實驗，只是大致篩選了3 種炮制品的抗炎效果和毒性作用，對于單一藥效或毒性成分在炮制前后發生的變化并不明晰，不能闡述“減毒存效”的炮制機制，有待進一步研究。