蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠BGP、BMD及股骨組織形態的影響?

趙 軍，李 昕，劉 巖，王雄耀，師建平△，董重陽，常 虹

1 內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010020； 2 內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050； 3 內蒙古醫科大學中醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110

蒙醫學將人類體質分幼少年、青壯年、老年等階段，老年處于體熱趨于減弱、營養降低時期，骨脆性增加。五元中骨屬土，赫依寓所，病變串行赫依之路，易發骨折等因糟粕、精華減弱功能。在蒙醫學中，骨質疏松屬赫依病范疇。絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）因絕經后女性卵巢功能衰退所致。蒙藥藍刺頭主治骨折筋傷、骨傷熱、金創等［1］。本研究觀察蒙藥藍刺頭對去卵巢OP 模型大鼠血清骨鈣素（bone gla protein，BGP）調節、股骨近干骺端骨密度（bone mineral density，BMD）、股骨近干骺端形態改變、骨髓脂肪改變，為蒙醫“補暖補精-清鎮赫依-固骨質壯骨”理論防治PMOP提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Wistar雌性4月齡大鼠77只，購于內蒙古大學實驗動物研究中心，實驗動物合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。內蒙古醫科大學基礎實驗樓病理實驗室，每籠11只，購回7天左右環境適應。

1.2 藥品及試劑藍刺頭制劑由廣州中醫藥大學提供；產地：新疆烏魯木齊市天山區；采摘時間：2018年7月。強骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，產品批號：188103，國藥準字Z20030007，規格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久聯制藥有限公司，產品批號：20180925，國藥準字H34021250，規格：0.5 mg/片）；骨鈣素ELISA 試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：20180953）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模 將63 只大鼠隨機平均分為7 組。復制PMOP 模型參考文獻［2］，創口縫合5 日后，大鼠陰道脫落細胞涂片［3］表示造模成功；假手術組造模方法：沿大鼠下腹部切開以后，找到大鼠卵巢，在卵巢周邊切除卵巢大小的脂肪。將造模成功的大鼠進行分組：蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組，己烯雌酚組、強骨膠囊組、模型組、假手術組，每組9只。見圖1—2。

圖1 動情間期光鏡下雌鼠陰道涂片（×400）

圖2 動情期光鏡下雌鼠陰道涂片（×400）

1.3.2 藥物干預 購回大鼠正常飼喂1 周后開始造模分組，90 天后給藥，蒙藥藍刺頭中、高、低劑量組依人鼠體質量比、人鼠代謝速率比折算分別以13.750 0、27.500 0、6.875 0 mg/mL 給予蒙藥藍刺頭溶液，臨床等效低劑量組為準，中、低、高劑量比例為2∶1∶4。強骨膠囊組給予濃度為23.437 5 mg/mL 的對應藥物，己烯雌酚組給予濃度為0.031 3 mg/mL 的對應藥物。模型組和假手術組給予相等毫升數的生理鹽水。

1.3.3 標本采集 采集大鼠血液離心檢測血清BGP；取雙側完整股骨，測左股骨BMD，右股骨用4%甲醛溶液固定HE染色。

1.4 觀察指標

1.4.1 BMD 計量學測定 顯微CT 下進行大鼠右股骨近干骺端BMD分析。

1.4.2 血清BGP 表達 采用酶聯免疫法測大鼠血清BGP表達，步驟按BGP試劑盒說明書進行。

1.4.3 大鼠左側股骨近端干骺端脫鈣［4］取5張切片，每組大鼠（n0）隨機選擇5 個視野，每張切片（n1），光學顯微鏡下觀察各組染色，股骨近干骺端組織形態、骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑計量。1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0 統計軟件行數據統計分析，計量資料以±s表示，方差齊性檢驗方差齊，多樣本均數比用方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠股骨BMD 計量顯微CT 掃描大鼠右側股骨近干骺端BMD 計量示：模型組與假手術組比差異有統計學意義（P＜0.01）；蒙藥藍刺頭中劑量組、假手術組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組與蒙藥藍刺頭高劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BMD及BGP計量比較（±s）

表1 各組大鼠BMD及BGP計量比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

BGP （ng/mL）組別鼠數BMD（g/cm3）185.1435±0.9832△201.1726±0.2259*183.4583±0.8954△198.3716±0.1563*199.1478±0.1325*174.3627±0.3684△△210.7642±0.1425**藍刺頭高劑量組藍刺頭中劑量組藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組模型組假手術組9 9 9 9 9 9 9 0.247±0.267△0.311±0.038*0.243±0.352*0.296±0.536*0.394±0.018*0.187±0.043△△0.398±0.059**

2.2 大鼠血清BGP 水平大鼠血清BGP 水平比較：模型組較假手術組、蒙藥藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組明顯降低（P＜0.01）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭高劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍刺頭中、低劑量組、假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍刺頭中劑量組、假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 大鼠左側股骨近干骺端形態學改變假手術組大鼠骨質疏松樣改變不明顯，骨小梁粗細均勻，結構完整，骨小梁之間連接較好，脂肪細胞、骨細胞形態清晰。模型組見骨松質結構改變，部分骨小梁明顯纖細或出現斷裂，連接不完整，骨質形態學破壞。蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組見骨松質骨小梁改變不明顯，未現明顯纖細、斷裂，相互連接好，結構完整。蒙藥藍刺頭高、低劑量組較模型組骨組織形態改善，差異不明顯。見圖3。

圖3 大鼠左側離體股骨近干骺端骨質形態學觀察（HE，×400）

2.4 大鼠左側離體股骨近干骺端骨髓脂肪細胞密度及脂肪細胞直徑左側股骨近干骺端HE 骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑，模型組與假手術組相比，明顯增高（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭中、低劑量組及假手術組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組相比，明顯降低（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭高劑量組與模型組相比，差別無統計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中、低劑量組及強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組與蒙藥藍刺頭高劑量組相比，明顯降低（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭中、低劑量組及強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。蒙藥藍刺頭高劑量組大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞增多，脂肪細胞體積較大，數量較多，密度有所增大。

蒙藥藍刺頭中劑量組大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞偏少，脂肪細胞體積較小、數量較少。蒙藥藍刺頭低劑量組大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞偏少，脂肪細胞分散，呈小圓球形。強骨膠囊組大鼠骨髓組織內可見脂肪細胞數量較少、密度小，脂肪細胞分散。己烯雌酚組大鼠骨髓組織內可見脂肪細胞密度小，脂肪細胞分散，呈小圓球形。模型組去除卵巢后大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞增多，脂肪細胞體積較大，骨髓脂肪細胞直徑明顯變大，數量較多，密度有所增大，一定數量的脂肪細胞聚集在一起，之間相互擠壓，呈圓形或多邊形。假手術組大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞偏少，脂肪細胞體積較小、數量較少、密度小，脂肪細胞分散，呈小圓球形。見表2、圖4。

表2 各組大鼠左側離體股骨近干骺端骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑比較（±s）

表2 各組大鼠左側離體股骨近干骺端骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

脂肪細胞密度（mm/mL）組別視野數（n0×n1）脂肪細胞直徑（μm）253.786±39.451△184.452±29.369*203.376±30.452*189.478±31.235*178.856±29.325*278.426±36.528△△167.746±28.429**藍刺頭高劑量組藍刺頭中劑量組藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組模型組假手術組25 25 25 25 25 25 25 43.287±3.872△30.176±2.634*27.478±2.943*28.754±2.756*29.368±2.541*46.542±3.837△△31.253±2.671**

圖4 各組大鼠光學顯微鏡下左側離體股骨近干骺端骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑（HE，×400）

3 討論

OP 以骨量單位體積降低，損壞骨微結構，骨礦物質、骨基質隨年齡增加（或婦女絕經）等比例減少，骨微結構改變致骨荷載正常功能變化，骨脆性增加，易發骨折［5］。BGP又稱骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是一種由骨骼中成骨細胞產生的非特異性膠原蛋白［6］。其病理性增高常見于骨轉換加快如高轉換型骨質疏松。脂肪增多對骨髓和骨骼強度的影響機制如下：一是脂肪含量在骨髓中增多是對松質骨內骨小梁變薄、數量減少、小梁間隙增大的代償填充［7-8］；二是骨髓填充骨小梁間隙對松質骨有機械支撐、緩沖能力作用［7］；三是OB和成脂細胞同祖［9］，二者同源骨髓脂肪間充質干細胞［10］。研究顯示，絕經后女性雌激素水平降低，牙周膜干細胞分化成骨下降［11-14］，說明雌激素通過調控成骨、破骨平衡調節重塑骨，促進干細胞分化成骨，抑制分化成脂。研究顯示：蒙藥藍刺頭具有植物雌激素樣作用，通過雌激素樣作用促成骨，調節骨吸收與骨形成偶聯，降低骨轉換，達防治PMOP 的目的［15-17］。本實驗結果表明，血清BGP、BMD、股骨、骨髓脂肪改變方面模型組與假手術組差別明顯；適當劑量蒙藥藍刺頭可有效降低血清BGP、提高BMD、改善股骨組織形態、抑制骨髓脂肪過快、過度表達。

綜上所述，大鼠在去卵巢以后血清BGP、股骨近端干骺端骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑表達計量結果均明顯增高，骨組織結構破壞嚴重，BMD 明顯降低；蒙藥藍刺頭使血清BGP 表達、骨髓脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑明顯降低，效果同己烯雌酚、強骨膠囊相似，為蒙醫“補暖補精-清鎮赫依-固骨質壯骨”理論防治PMOP 提供實驗依據，其詳細機制、作用通路需進一步研究。