白芍總苷對腹瀉型腸易激綜合征大鼠5-HT 信號通路的影響?

孫燕寧，符梅竹

1 臨高縣人民醫院，海南 臨高 571800； 2 海南醫學院第一附屬醫院，海南 海口 570102

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）為不伴消化道器質性改變或生化異常的胃腸功能紊亂性疾病，是以持續或間歇發作的大便性狀或排便習慣改變、腹痛、腹脹等為主要表現的臨床綜合征［1］。根據臨表現可將IBS 分為腹瀉型（predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）、便秘型、混合型以及未定型，IBS-D 約占74.1%，屬于最為常見的類型。IBS在20～50歲中青年人群中多見，女性多于男性。流行病學研究發現，全世界IBS 發病率為11%～30%，我國約為5%～6%［2-3］，近年來有逐年增多的趨勢，嚴重影響患者的正常工作、生活。在臨床中，西醫主要采用飲食調整、解痙劑、益生菌、止瀉藥、益生菌等進行對癥治療。中醫藥從整體觀念出發，在該病的治療方面積累了豐富的臨床經驗。白芍總苷為中藥白芍的活性成分。石君杰等［4］研究認為，高劑量白芍總苷治療IBS 大鼠的療效與匹維溴銨接近，但關于其治療IBS-D 的相關研究較少。本次研究主要探討白芍總苷對IBS-D 模型大鼠5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的影響，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體SPF 級健康成年Wistar大鼠68只，雌雄各半，體質量180～220 g，平均（203.26±11.29）g，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2018-0002。大鼠分籠飼養于溫度23～27 ℃、濕度60%、安靜通風的動物房內，晝夜規律為12 h，大鼠自由飲水、進食、活動，飲用水為自來水，飼料為標準顆粒飼料。實驗經過醫院倫理委員會批準（倫理批號：2018011004）。

1.2 藥品及試劑白芍總苷（CAS 號：23180-57-6，純度≥98%，西安立森生物科技有限公司，規格：20 mg/瓶），采用蒸餾水配制成濃度為5、10 mg/mL的白芍總苷溶液，現用現配。匹維溴銨片（法國Abbott Healthcare SAS 公司，批號：20190216，50 mg/片），使用時研碎成末，用蒸餾水配制成濃度為3.75 mg/mL 的匹維溴銨混懸液，現用現配。磷酸鹽緩沖液（PBS）、含吐溫20 的Tris 鹽酸緩沖液（TBST）（南京賽泓瑞生物科技有限公司）；5-HT免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京凱瑞基生物科技有限公司）；RIPA 組織裂解液（上海易匯生物科技有限公司）；兔抗鼠色氨酸羥化酶1（Tryptophan hydroxylase1，TPH-1）、5-羥色胺受體3（5-HT3 receptors，5-HT3R）、5-羥色胺轉運蛋白（serotonin transporter，SERT）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標記抗體）（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（南京善本生物科技有限公司）；ECL化學發光檢測試劑盒（環亞生物科技有限公司）。

1.3 儀器TGL-16R 型離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；ZT-12P 生物組織自動脫水機（孝感亞光醫用電子技術有限公司）；EM-3000 型光學顯微鏡（日本多美公司）；TP-214 型電子分析天平（美國丹佛儀器有限公司）；JS-power300 型電泳儀（上海培清科技有限公司）；VE-186 型轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模［5］及分組 進行為期5天的適應性飼養后，將所有大鼠隨機分為正常組13 只和造模組55 只。正常組大鼠正常飼養，造模組大鼠每日用固定籠束縛1 h，同時隨機給予以下刺激中的1種，而且連續2 天不給予同種刺激：禁食或禁水24 h；夾尾至大鼠發出嘶叫1 min；置于40 ℃環境內5 min；水平震蕩45 min（頻率每分鐘150次，幅度10 cm）；置于4 ℃水內游泳3 min。持續刺激21天后，若造模組大鼠體質量增長低于正常組，24 h Bristol糞便評分［6］為6～7 分，腹壁撤退反射（AWR）評分明顯高于正常組，即認為成功建立IBS-D模型。

將造模成功的52 只大鼠隨機分為模型組、匹維溴銨組及白芍總苷低、高劑量組，每組13 只。模型組、正常組分別給予蒸餾水0.1 mL/10 g 灌胃，每日1次；匹維溴銨組給予3.75 mg/mL匹維溴銨混懸液0.1 mL/10 g 灌胃，每日1 次；白芍總苷低、高劑量組分別給予5、10 mg/mL 白芍總苷溶液0.1 mL/10 g灌胃，每日1次。各組連續治療14天。1.4.2 標本采集與處理 腸道敏感性測定結束后，處死大鼠，迅速打開腹腔取結腸組織，4 ℃生理鹽水沖洗干凈，其中1/2 段組織采用4%多聚甲醛固定24 h，經自動脫水機脫水后石蠟包埋，制備4 μm組織切片，用于免疫組化染色；剩余結腸組織采用液氮凍存，用于蛋白質免疫印跡（Western blot）檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠糞便含水量檢測 末次給藥后，采用代謝籠收集大鼠24 h 糞便，迅速稱量濕重，然后烘干，稱量干重，依據公式計算糞便含水量：

糞便含水量（%）=（1-糞便干重/糞便濕重）×100%

1.5.2 大鼠腸道敏感性測定［7］糞便含水量檢測結束后，所有大鼠禁食不禁水24 h，將大鼠置于固定透明塑料盒內，使之無法轉身，僅將尾部露出，采用乙醚麻醉大鼠，用石蠟油潤滑肛門，將帶球囊的導尿管插入5 cm，固定在尾巴上；大鼠蘇醒后30 min，將導尿管與血壓計袖帶充氣管連接、密封，擠壓氣囊，觀察大鼠在40 mmHg（1 mm Hg≈0.133 kPa）、60 mm Hg壓力下的結直腸擴張時AWR評分，每次擴張20 s，每種壓力測量3 次，取平均值。結直腸擴張時AWR 評分標準［8］：大鼠無反應，計0分；頭部短暫靜止，計1分；腹部收縮但不抬離桌面，計2 分；腹部收縮且抬離桌面，計3 分；身體呈弓形，骨盆抬高，計4分。

1.5.3 免疫組化法檢測大鼠結腸組織5-HT 表達水平［9］取“1.4.2”項中制備的組織切片，常規脫蠟水化，蒸餾水沖洗3次，每次5 min；然后置于3%過氧化氫溶液內8 min，以去除內源性過氧化氫酶，蒸餾水沖洗3 次，每次5 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min，置于0.01 mmol/L 枸櫞酸緩沖液內（PH=6.0），微波爐高火加熱10 min 進行抗原修復；恢復至室溫后，PBS 沖洗3 次，每次5 min，按照免疫組化試劑盒說明中的步驟，滴加兔抗鼠5-HT 一抗（1∶100稀釋），4 ℃反應16 h；PBS沖洗3 次，每次3 min，滴加二抗，室溫反應30 min；PBS 沖洗3次，每次3 min，采用DAB試劑盒進行顯色；自來水沖洗后，采用蘇木素染液復染；常規脫水、透明、中性樹膠封固。在光學顯微鏡下觀察染色結果，5-HT 陽性細胞呈棕黃色或黃色，每張切片于400×鏡下隨機選擇5 個不重復視野，計數5-HT 陽性細胞個數，計算平均值。

1.5.4 Western Blot 法檢測大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R、SERT 表達水平［10］取“1.4.2”項中凍存的結腸組織，加入9倍體積預冷的RIPA裂解液，電動勻漿器勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃條件下，離心半徑：15 cm，以13 000 r/min 離心20 min，用超微核酸蛋白檢測儀檢測上清液總蛋白濃度，采用5×還原樣品緩沖液將蛋白樣品濃度調整為4 mg/mL，100 ℃沸水浴5 min 后等待上樣；配制SDS-PAGE12%分離膠和5%濃縮膠，灌注于電泳槽內；取蛋白樣品每孔加樣20 μg，應用濕轉法轉膜，電流300 mA，時間1 h，轉印并將NC 膜浸沒于3%牛血清白蛋白內，進行封閉，添加入TPH-1、5-HT3R、SERT 及β-actin 一抗、二抗內；TBST 洗滌6 次，每次3 min；ECL發光液鋪于NC膜并于暗室內曝光、顯影、定影。采集蛋白條帶圖像，用NIH Image 軟件分析各蛋白條帶光密度值（OD 值），計算TPH-1、5-HT3R、SERT相對于β-actin的表達量。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件包分析，符合正態性的計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠糞便含水量與正常組比較，模型組大鼠糞便含水量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、高劑量組和匹維溴銨組大鼠糞便含水量較低，且白芍總苷低劑量組＞白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠糞便含水量、AWR評分及5-HT陽性細胞數量比較（±s）

表1 各組大鼠糞便含水量、AWR評分及5-HT陽性細胞數量比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與白芍總苷低劑量組比較，P＜0.05；▲表示與白芍總苷高劑量組比較，P＜0.05

組別鼠數不同壓力下AWR評分（分）40 mm Hg 糞便含水量（%）60 mm Hg 5-HT陽性細胞數（個）正常組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷高劑量組匹維溴銨組13 13 13 13 13 1.31±0.16 2.74±0.22*2.13±0.12*#▲1.71±0.14*#△1.68±0.11*#△161.028 0.000 38.72±1.37 59.86±2.05*50.47±2.18*#▲46.25±1.62*#△45.97±1.74*#△236.339 0.000 F P 1.73±0.28 3.32±0.24*2.81±0.30*#▲2.24±0.21*#△2.19±0.17*#△82.407 0.000 6.18±0.35 22.47±0.74*16.35±0.42*#▲8.03±0.56*#△7.91±0.62*#△2048.774 0.000

2.2 不同壓力下大鼠AWR 評分與正常組比較，模型組大鼠40、60 mm Hg 壓力下AWR 評分顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、高劑量組和匹維溴銨組大鼠40、60 mm Hg 壓力下AWR 評分較低，且白芍總苷低劑量組＞白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠結腸組織5-HT 表達水平比較免疫組化染色結果顯示，5-HT 陽性細胞主要分布于結腸黏膜肌層、固有層和黏膜下層，各組陽性細胞數目及染色程度不同。半定量分析顯示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織5-HT 陽性細胞數明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、高劑量組和匹維溴銨組大鼠結腸組織5-HT 陽性細胞數均較低，且白芍總苷低劑量組＞白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織5-HT表達結果（免疫組化染色，×400）

2.4 大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R、SERT 表達水平與正常組比較，模型組大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R 表達水平明顯升高，SERT 表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、高劑量組和匹維溴銨組大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R 表達水平均較低，且白芍總苷低劑量組＞白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、高劑量組和匹維溴銨組大鼠結腸組織SERT 表達水平較高，且白芍總苷低劑量組＜白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2，圖2。

圖2 各組大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R、SERT表達電泳圖

表2 各組大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R、SERT表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠結腸組織TPH-1、5-HT3R、SERT表達水平比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與白芍總苷低劑量組比較，P＜0.05；▲表示與白芍總苷高劑量組比較，P＜0.05

SERT/β-actin 0.98±0.11 0.26±0.03*0.42±0.05*#▲0.79±0.09*#△0.81±0.07*#△204.739 0.000組別正常組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷高劑量組匹維溴銨組鼠數13 13 13 13 13 F P TPH-1/β-actin 0.31±0.04 0.97±0.12*0.82±0.09*#▲0.54±0.08*#△0.56±0.07*#△122.380 0.000 5-HT3R/β-actin 0.15±0.02 0.49±0.07*0.35±0.04*#▲0.21±0.02*#△0.20±0.03*#△152.988 0.000

3 討論

IBS-D 的發生是精神心理狀態、性別、遺傳、飲食習慣、社會環境等多種病理因素影響的結果，發病機制尚不明確，主要涉及胃腸動力異常、內臟高敏感性、腸道感染、腦-腸軸與胃腸激素異常等方面［11］。5-HT 屬于常見的腦腸神經遞質和信號分子，在胃腸動力、內臟敏感性等的調節方面均發揮著重要作用，其受體也參與IBS-D的發生發展的過程。燕李晨等［12］研究稱，5-HT在IBS的發病機制中起到關鍵作用，將調控5-HT 信號系統作為靶點的藥物為IBS防治研究提供了新的方向。

中醫認為，IBS-D 屬于“腹痛”“泄瀉”“郁證”等范疇［13］，病位在腸，主要病機為肝郁、脾虛、濕盛，肝氣郁結，伐克脾土，脾虛運化失司，水濕不化，清瀉而下，發為本病。研究表明，白芍是中醫藥治療IBS 中使用頻率較高的藥物［14］。此外，白芍總苷還具有調消炎鎮痛、抑制自身免疫反應、抗抑郁、肝腎保護等多種作用［15］。李祥鴻等［16］研究認為，芍藥苷能通過上調緊密連接蛋白ZO-1 和核因子抑制蛋白κB 而緩解IBS。李瑜等［17］研究稱，芍藥苷能有效降低IBS 模型大鼠結腸頻率，使結腸肌峰電位、峰面積、峰峰值等降低，降低腸道敏感性，對IBS大鼠發揮治療作用。

本研究結果表明，與模型組比較，各用藥組大鼠糞便含水量較低，40、60 mm Hg壓力下AWR評分較低，且白芍總苷低劑量組＞白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組，證實了白芍總苷可改善IBS大鼠糞便性狀，減輕腹瀉，同時降低腸道敏感性，治療效果與匹維溴銨相當，且白芍總苷呈現一定的量效關系。

TPH-1、5-HT3R、SERT 均為5-HT 信號通路中的重要分子。TPH-1 分布于胃腸道中，為5-HT 生物合成的限速酶，可直接影響5-HT 的代謝功能，降低其表達水平對于減少5-HT 合成有積極意義。5-HT3R 是導致內臟高敏感發生的重要機制之一［18］。SERT 為調控5-HT再攝取的跨膜轉運蛋白，能促進5-HT 重新進入突觸前神經末梢，使之失活，減少5-HT 堆積，進而影響腸道感覺和功能。有研究發現，IBS-D 患者結腸5-HT 含量高于對照組，SERT陽性率低于對照組，SERT表達降低或缺失可致5-HT 滅活不足，這與IBS 發病機制有關［19-22］。本研究結果顯示，與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織5-HT 陽性細胞數及TPH-1、5-HT3R 表達水平均較低，SERT表達水平較高，且白芍總苷高劑量組和匹維溴銨組改變與模型組差異最明顯，表明白芍總苷能下調結腸組織TPH-1、5-HT3R 表達，上調SERT表達，降低5-HT水平，這可能是白芍總苷改善IBS大鼠腸道敏感性，治療IBS的作用機制之一。

綜上所述，白芍總苷能劑量依賴性地改善IBS-D 大鼠神腹瀉癥狀，降低腸道敏感性，抑制結腸組織5-HT表達，其作用可能與調節5-HT信號通路中的TPH-1、5-HT3R、SERT表達有關。