子宮內膜異位癥關鍵基因與相關治療中藥的生物信息學分析?

顧鳳群，李衛紅，寧 敏，覃 婷

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種復雜的婦科疾病，影響5%～10%的育齡期女性，可引起長期的慢性盆腔痛、痛經、性交困難及盆腔器官功能障礙，還可干擾內分泌影響卵巢功能，降低生殖能力［1-3］。目前，EMs的發病機制尚未明確，但研究發現，與子宮內膜具有相似生物學特征的異位內膜組織在腹腔侵入、種植并發生周期性出血，可起局部持續的炎癥性反應，而持續的炎癥促進內膜的黏附種植及血管生成［4］。此外，EMs患者血清、腹腔液和異位病灶中的細胞因子存在異常的免疫炎癥反應［5-7］，因此，免疫-炎癥反應被認為是EMs 發生發展的重要機制。目前治療EMs 主要以改善癥狀為主，手術治療復發率極高。

根據EMs 的癥狀及體征，可歸屬于中醫學“不孕”“癥瘕”“痛經”“婦人腹痛”等范疇。因EMs 患者血液呈高黏稠性、異常的微循環及血流動力學改變，與中醫血瘀的特征相似，故瘀血是EMs 的病理狀態。近代醫家以活血消癥法治療EMs 取得良好的療效，如化瘀消癥中藥湯可有效抑制異位囊腫，緩解內膜異位癥疼痛，改善患者的癥狀［8］。補腎祛瘀方可改善EMs 患者的盆腔微循環，促進血流運行，減輕患者疼痛［9］。本研究從GEO數據庫篩選EMs 的表達譜芯片，運用生物信息學技術挖掘參與EMs 發病機制的關鍵基因、通路以及作用于關鍵基因的miRNAs，最后預測治療EMs 的有效中藥成分，為中醫藥治療EMs提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源數據集GSE25628［10］來源于NCBI的GEO（gene expression omnibus）數據庫，基于GPL571 平臺（HG-U133A_2）Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array。該芯片含有22人子宮內膜組織樣本的基因表達譜數據集，包括6 例正常健康的子宮內膜樣本，16例異位子宮內膜組織。

1.2 DEGs的篩選運用在線工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對數據集GSE25628 進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選，把數據集中沒有注釋的探針及重復對應多個基因的探針刪除，篩選標準為adj.P.Val＜0.01，log FC＞2或log FC＜2，并將探針名稱轉化為標準基因名稱，將篩選出的DEGs的差異表達情況用熱圖進行直觀展示。

1.3 基因功能富集和注釋使用metascape（https：//metascape.org/）數據庫對DEGs 進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 富集包括分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）及 細 胞 組 分（cell component，CC），并將結果進行可視化。利用京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路數據庫進行信號通路的富集，尋找差異表達基因所富集的關鍵通路并將結果可視化。

1.4 差異表達基因的相互作用分析對DEGs 進行蛋白互作網絡構建及分析，STRING 數據庫（https：//string-db.org/）和Cytooscape 軟 件是用來構建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡的主要工具。首先使用STRING 11.0 對DEGs 構建蛋白互作關系對，選取combined score＞0.4（中等可信度）的蛋白互作關系對導入Cytoscape 3.7.0 軟件進行網絡可視化。在PPI網絡中，利用cytoHubba插件選擇最大相關標準（matthews correlation coefficient，MCC）中的基因作為hub基因。

1.5 在ToppGene數據庫檢索DEGs相關miRNADEGs在體內表達水平發生異常變化可能誘導疾病的發生，在真核生物體內，基因表達水平主要受轉錄后調控。miRNA 可通過靶向mRNA 的3'UTR（3'untranslated regions）區抑制mRNA 翻譯或使其發生降解從而發揮轉錄后調控作。在ToppGene 數據庫（https：//toppgene.Cchmc.org/）檢索靶向關鍵基因的miRNA。參數設定值：1）Correction，FDR；2）P-Value cut off，0.05；3）Gene Limts，1≤n≤2000；4）Source，MiRNA.org。

1.6 預測治療EMs的有效藥物比較毒物遺傳學數據庫（comparative toxicogenomicsdatabase，CTD），篩選關鍵基因的候選藥物CTD 數據庫（http：//ctdbase.org/），整合了多種生物的重要數據，可提供關于基因與化合物之間相互作用的信息，是進行藥物篩選的重要工具。在CTD 數據庫中，導入關鍵基因篩選出對這些關鍵基因具有潛在作用的化合物作為EMs的潛在治療藥物。

2 結果

2.1 GO 功 能 富 集 分 析DEGs 采 用metascape 對49 個DEGs 進行GO 功能富集分析（P＜0.05），DEGs主要涉及端粒維護、超分子纖維組織的調節、ERBB2 信號通路、蛋白質聚合的調控等生物過程，介導細胞黏附分子結合、激酶活性等分子功能，主要富集于細胞質核區、錐體、雙鏈斷裂的站點；DEGs 主要富集于癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞凋亡等經典通路。GO 和KEGG 富集分析顯著性如1圖所示

2.2 EMs 相關DEGs 的 篩 選GSE25628 數 據 集 中篩選到49 個DEGs，其中上調5 個，下調44 個。利用熱圖可直觀顯示出DEGs 表達水平變化主要以下調為主，如圖2。

圖2 GSE25628熱圖，紅色代表上調基因，藍色代表下調基因

圖3 Hub基因的PPI

表2 關鍵基因篩選的潛在治療藥物

圖1 A、B圖為DEGs的GO功能富集，C圖為DEGs的KEGG富集通路

2.3 DEGs 中Hub 基因的PPl采用Cytoscape 3.6.1 軟件將PPI 網絡可視化，利用cytoHubba 插件選擇最大相關標準（MCC）中的前8 個基因作為hub 基因，分別為ATRX、SMC5、TPR、HSP90AA1、HI‐RA、RAD50、CEP290、PIK3R1，節點顏色越深代表分值越高，提示與EMs的發生發展越密切相關。

2.4 與關鍵基因相關的miRNA預測分析PPI 網絡中篩選的關鍵基因均屬于下調基因，可能是導致EMs發病的重要因素。利用ToppGene數據庫檢索到與上述關鍵基因相關的miRNAs 有84 個，miRNAs 可能通過作用于不同的關鍵基因的3'UTR區產生負調控作用，選取與關鍵基因相關聯最顯著的前十個miRNAs。

2.5 EMs治療的候選藥物篩選結果在CTD藥物數據庫中檢索能夠減少關鍵基因表達的藥物，即可能對EMs 具有潛在治療效果的藥物，根據每個藥物對應關鍵基因數目進行排序，前4 種植物藥分別是植物提取物、木黃酮、白藜蘆醇、槲皮素。

表1 關鍵基因對應miRNA的預測

3 討論

EMs 是多因素疾病，為激素、免疫、雌激素、表觀遺傳及環境等因素共同作用所致，雖為良性，卻有侵襲、黏附、轉移、易復發等與惡性腫瘤相似的特性。研究表明，激素失常、內分泌失調導致一個持續性的炎癥微環境，異位微環境能聚集多種細胞產生抗炎細胞因子，促進子宮內膜異位組織血管的生成、組織黏附和侵襲［11-12］。異位組織可能分泌免疫調節蛋白（如細胞間黏附分子-1）干擾腹腔免疫監視，使反流的子宮內膜逃過吞噬和清除，從而在腹腔種植生長。異位病變組織還可增加生長因子（如神經生長因子、轉化生長因子-β）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，可促進異位組織附近神經和毛細血管的募集，為增殖的異位內膜提供充足的血液營養［13］。此外，研究發現異位細胞抗凋亡、自噬參與EMs 發展過程的始終，可能與腹腔長期炎性環境有關，具體生理病理機制仍未明確［14-15］。本研究從GSE25628 數據集篩選到49 個DEGs，其中有44 個上調DEGs，對DEGs 進行富集功能分析，DEGs 主要涉及端粒維護、超分子纖維組織的調節、ERBB2 信號通路、蛋白質聚合的調控等生物過程，介導細胞黏附分子結合、激酶活性等分子功能，主要富集于細胞質核區、錐體、雙鏈斷裂的站點；DEGs 主要富集于癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞凋亡等經典通路。其中酪氨酸激酶受體2又稱人表皮生長因子受體2可調控細胞生長、增殖、分化和凋亡。DEGs 富集于癌癥相關通路，與EMs 具有與癌癥相似的生物學特征相符，并且流行病學發現，子宮內膜異位癥增加了卵巢癌發生的風險，它可能是透明細胞和子宮內膜異位卵巢癌的前體病變［16］。在月經周期中，內膜細胞凋亡增加可維持細胞平衡，促進成熟細胞脫落排出體外，研究發現細胞凋亡率降低可能激活NF-κB 通路，使異位內膜細胞大量增殖，從而導致EMs 的發展［17］。

篩選的關鍵基因為ATRX、SMC5、TPR、HSP90AA 1、HIRA、RAD50、CEP290、PIK3R1。ATRX 是一種染色質重塑復合物，也是表觀遺傳調控因子，可以調控與腫瘤進展相關的信號通路。研究發現在缺失ATRX 的細胞中轉化生長因子β2、黏蛋白16（mucoprotein16，MUC16）和CXC 型趨化因子（c-xcmotif chemokine ligand 8，CXCL8）的表達顯著上調，MUC16 編碼的癌胚抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是經典的腫瘤標志物，ATRX介導MUC16 的低表達可抑制異位細胞的聚集、黏附、遷移及侵襲性，導致細胞凋亡，從而抑制它們的增殖。CXCL8基因編碼白細胞介素8，不僅能夠促進血管生成，激活轉移相關的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），還可以改變細胞凋亡的相關通路［18］。熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1）是廣泛存在于真核細胞中的高度保守的分子伴侶，參與細胞生長、發育、分化、基因轉錄，參與腫瘤細胞的增殖分化，促進腫瘤組織血管生成和轉移。研究發現，HSP90AA1可以通過調節VEGF表達誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤的增殖和轉移［19］。TPR（translocated promoter region）是一種保存的核孔復合物（nuclear pore complex，NPC）蛋白質，它包含幾個盤繞的線圈結構域，其最初的N-末端部分被證明能夠形成二聚體［20］。TPR 被證明在許多核過程中發揮作用，即調節mRNA 輸出［21］，作為信號蛋白的支架元件，參與調節有絲分裂過程［22-23］。雙鏈斷裂修復蛋白（double strand break repair protein，RAD50）存在于細胞核中，是維持染色體結構穩定的重要蛋白，能夠與雙鏈斷裂修復核酸酶形成MRN復合體，在識別DNA雙鏈斷裂損傷并修復的過程中發揮著重要的作用。研究發現，有RAD50 基因表達的腫瘤血管更少，因此RAD50 被認為是抑制腫瘤生長的重要靶點。PI3K 是由一個催化亞基（P110）和一個調節亞基（p85α）組成的二聚體酶，p85α 是由磷脂酰肌醇-3-激酶，調節亞單位1（PI 3 Kinase p85 alpha，PIK3R1）編碼的。AI等［24］研究證實敲除PIK3R1 基因可抑制了細胞的遷移，促進細胞系的凋亡。降低PIK3R1 的表達會損害B 細胞發育和增殖，延緩胚胎發育和抑制細胞黏附［25］，PIK3R1 還可以通過PI3K/AKT 信號參與了細胞的的遷移和侵襲［26］。SUDA 等［27-28］研究發現，PIK3R1 在子宮內膜異位癥中反復發生突變，與細胞增殖、侵襲和減少凋亡有密切關系。

在人類子宮內膜異位癥中，細胞增殖和細胞周期調控基因也受到不同miRNAs 的調控。REKKER 等［29］研究表明，子宮異位內膜間質細胞miR-139-5p的miRNA是廣泛上調的；miR-183涉及細胞生長、細胞分化、凋亡、細胞活力、細胞黏附和細胞入侵的調節［30-31］。HSP90 為miR-628-3p 的潛在靶基因，miR-628-3p 通過抑制HSP90 的表達促進異位內膜細胞凋亡，從而抑制異位內膜的遷移、侵襲［32］；miR-103、miR-107 已被證明可以抑制細胞增殖，調節脂質代謝和炎癥［33-34］；miR-147 是巨噬體炎癥反應的負穩壓器，研究表明miR-147 參與一個負反饋回路，能夠抑制巨噬細胞對多個TLR 配體的抗炎反應［35］。上述研究表明，通過干預調控不同基因的miRNAs 的表達，可抑制異位內膜細胞的侵襲、轉移，促進其凋亡。

近年來，中醫藥治療EMs 療效顯著，中醫藥干預EMs 的發病機制亦成為研究熱點。祝燕莉等［36］研究發現，內異方可通過調控相關通路明顯改善EMs 的炎癥微環境，抑制異位內膜的浸潤、黏附、侵入，達到治療EMs 的目的。張亞萍等［37］研究發現，蠲痛飲通過下調PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白的表達，抑制上皮間質細胞活性，促進異位內膜細胞的凋亡?？梢?，研究中藥的主要成分對治療EMs具有重要的臨床意義。本研究中木黃酮屬于植物雌激素，通過與雌激素-β受體的選擇性相互作用來影響細胞功能，從而調控下游信號［38］。研究表明，木黃酮具有抗炎和抗血管生成作用，主要通過抑制脂多糖誘導的促炎細胞因子的表達和釋放來抗炎，也可以通過抑制血管內皮生長因子的表達或分泌來抗血管生成［39-40］。SUTRISNO 等［41］研究表明，木黃酮能調節雌激素受體α 和雌激素受體β，抑制子宮內膜異位癥小鼠腹腔炎癥和血管生成。白藜蘆醇是一種植物性多酚，具有抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗血管生成、抗氧化、抗炎等特性，通過抑制環氧合酶的合成，抑制促炎細胞因子的合成和釋放，抑制活化的免疫細胞，從而抑制前列腺素的合成，同時也可抑制促血管生成因子VEGF 和MMPs，抑制血管內皮細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移，從而發揮其抗癌和抗動脈粥樣硬化的作用［42-43］。OZCAN 等［44］研究表明，白藜蘆可明顯縮小子宮內膜異位組織，降低子宮內膜異位植入物的VEGF表達及腹膜液和血清血管內皮生長因子A和單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）趨化因子的水平，還可抑制子宮內膜細胞的增殖、侵襲，促進其凋亡［45］。白藜蘆醇通過抑制VEGF 基因的表達和合成而發揮抗血管生成作用，并可能通過其抗炎作用抑制細胞因子誘導的MCP-1 在各種培養組織和免疫細胞中的表達、合成、分泌、受體活性和趨化活性，從而改善EMs 腹膜內微環境［46-47］，達到治療EMs 的目的。PARK 等［48］研究了槲皮素對人子宮內膜異位癥細胞抗增殖和促凋亡的作用，結果表明，槲皮素可通過細胞周期停滯有效抑制細胞增殖，通過DNA 片段化誘導細胞凋亡，并伴有線粒體膜功能障礙和活性氧的產生。此外，槲皮素使ERK1/2、P38 和PI3K 信號蛋白磷酸化失活，抑制兩種細胞系的增殖。

綜上所述，本研究從GSE25628 芯片篩選影響EMs 發病的關鍵基因、通路及調控關鍵基因作用于EMs 的miRNAs，最后預測治療EMs 的中藥有效成分，為進一步研究EMs 的發病機制提供新的思路，也為中醫藥治療EMs 的有效性提供理論依據，但本研究后續進行相關實驗的驗證。