基于網絡藥理學探討“土茯苓-川牛膝”藥對治療痛風性關節炎的作用機制?

王玉天，朱躍蘭，席雅婧

1 北京中醫藥大學，北京 100029； 2 北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078

痛風性關節炎（gouty arthritis，GA）是由于嘌呤代謝紊亂和（或）排泄異常導致血尿酸升高，進而引起尿酸鹽結晶，在關節沉積并引發組織炎癥和損傷的一種疾病［1］，同時痛風石、痛風腎亦是其常見并發癥［2］。在我國，GA 發病率呈逐年增高趨勢，且以男性居多［3］。目前，現代醫學治療痛風的方法主要是消炎止痛及降尿酸等，相關治療藥物具有明顯的胃腸道、心血管及腎功能不全等方面的副作用。與之相比，中醫藥治療GA 具有辨證論治、安全性高等優勢。

土茯苓味甘、淡，性平，歸肝、胃經，具有除濕，解毒，通利關節等功效，為治療濕濁下注及濕瘡濕疹之佳品，常用于治療GA。川牛膝味甘、微苦，性平，歸肝、腎經，具有活血通經，祛風除濕，利尿通淋等功效，并可引血下行。土茯苓-川牛膝為治療GA 的主要藥對［4-6］，使用頻率較高，二藥合用有除濕活血、通利關節之功，尤適用于濕熱瘀阻型痛風。現代藥理學對土茯苓、川牛膝雖有一定研究，但其作用機制及物質基礎尚未完全明確，因此，本研究基于網絡藥理學探究土茯苓-川牛膝治療GA的作用機制，為治療GA提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 茯苓-川牛膝活性成分的篩選從TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［7］中藥數據庫檢索土茯苓、川牛膝的主要化學成分。藥物在體內需要經過吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion）過程，到達靶器官發揮藥效，因此，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）［8］和 藥 物 相 似 性（druglikeness，DL）［9］作為篩選條件對各味中藥化學成分進行篩選，將其設定為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出土茯苓、川牛膝主要活性成分。

1.2 活性成分潛在靶點的收集與篩選通過TCMSP 數據庫收集主要活性成分的潛在蛋白靶點，將篩選得到的靶蛋白英文名輸入到Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）中，篩選出物種為“人”的靶點，得到成分靶點基因，并進行標準化命名。同時，將TCMSP 數據庫篩選出的主要活性成分導入Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索對應SMILES 結構，將獲得的SMILES 結構導入Swiss Target Prediction數 據 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，將物種設定為Homo sapiens，以置信度閾值（Probability）評估預測結果的可靠性，并選取Probability≥0.5 的靶點作為較可靠的預測靶點。剔除無靶點活性成分，將預測靶點與TCMSP 數據庫收錄的靶點取并集并去重從而獲得主要活性成分的所有潛在靶點。

1.3 GA 相關靶點的獲取及篩選以“Gout”“Arthritis，Gouty”為檢索關鍵詞在OMIM 數據庫（https：//omim.org/）、TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）以及CTD 數據庫（http：//ctdbase.org/）收集與GA相關的靶點，去重后得到疾病候選靶點基因。其中，CTD 數據庫以Inference Score≥20為篩選限定條件。

1.4 土茯苓-川牛膝主要活性成分與GA 共同靶點的獲取利用Venny 2.1 在線程序（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將土茯苓-川牛膝活性成分潛在靶點與GA 相關靶點進行匹配，繪制韋恩圖并獲得土茯苓-川牛膝與GA 的共同靶點，并利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“中藥-重要活性成分-疾病靶點”作用網絡圖。

1.5 核心靶點蛋白相互作用（protein-proteininteraction,PPl）網絡構建將共同靶點導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/），設定物種為“Homo snpiens”，設定最低要求互動分數為中度信度0.400，其他參數保持默認值，得到PPI網絡圖以及相關信息，將其中條目node1，node2和Combined score數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，借助“Network Analyzer”功能對網絡進行拓撲分析，獲取相關拓撲參數，以大于節點連接度（degree）、節點緊密度（closeness）和節點介度（betweenness）的中位數作為篩選依據獲得關鍵靶點。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析將關鍵靶點導入至Metascape平臺進行GO功能富集和KEGG 通路富集分析，其中設置閾值P＜0.01，最小計數為3，富集因子＞1.5，并對P值取負對數，-logP值越大表明富集程度越大。GO 富集依據分子功能（molecular function，MF），生物學過程（biological process，BP）及 細 胞 組 分（cellular component，CC）進行。

2 結果

2.1 土茯苓-川牛膝藥效成分篩選本研究利用TCMSP 數據庫檢索土茯苓、川牛膝兩味中藥，根據口服生物利用度及類藥性共篩選出19 種候選藥效成分，其中土茯苓15 種，川牛膝4 種，剔除重復值及無靶點成分后，獲得17 種藥效成分，各藥效成分詳見表1。

表1 土茯苓-川牛膝藥效成分篩選結果

2.2 土茯苓-川牛膝藥效成分靶點預測及篩選在TCMSP 數據庫中篩查藥效成分靶蛋白并輸入Uniprot 數據庫得到靶點基因217 個；采用Pubchem 數據庫搜索在TCMSP 數據庫中篩查到的藥效成分SMILES 結構并輸入Swiss Target Prediction，得到預測靶點基因10 個。將兩種方法篩選到的靶點基因取并集并刪除重復靶點，共篩選出220個藥效成分作用靶點。

2.3 GA 相關靶點及中藥與疾病共同靶點的篩選通過OMIM、TTD、DisGeNET、CTD 等數據庫分別獲得GA 相關靶點1205、16、246、110 個，去重后共獲得相關靶點1494 個。將“土茯苓-川牛膝”藥對活性成分潛在靶點與GA 相關靶點進行匹配，獲得“土茯苓-川牛膝”藥對與GA 的共同靶點72 個，并繪制韋恩圖，見圖1，并構建“中藥-重要活性成分-疾病靶點”作用網絡圖，見圖2。

圖1 土茯苓-川牛膝與GA交集靶點韋恩圖

圖2 土茯苓-川牛膝-活性成分-GA靶點網絡圖

2.4 核心靶點PPl 網絡的構建分析及關鍵蛋白的篩選將72 個共同靶點導入數據庫，得到PPI網絡圖，見圖3。該網絡包括72 個節點、1017 條邊、平均節點度為28.2、平均局部聚類系數為0.699；對網絡進行拓撲分析，篩選獲得關鍵靶點28個。見表2。

圖3 土茯苓-川牛膝與GA共同靶點PPI網絡（節點越大，連接度越高）

表2 土茯苓-川牛膝治療GA關鍵靶點信息（按degree排序）

2.5 GO 富集分析將28 個關鍵靶點上傳至Metascape 平臺，經過GO 注釋富集分析共得到49個MF、872 個BP、24 個CC。富集程度居前10 位的條目見圖4。分析結果顯示：關鍵靶點主要分布于膜筏、膜微區、膜區、小窩、質膜筏、分泌顆粒腔、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、細胞質囊泡腔、囊泡腔、轉錄因子復合體等細胞成分中，通過細胞因子受體結合、核心啟動子結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、激活轉錄因子結合、核心啟動子序列特異性DNA 結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合、血紅素結合、四吡咯結合、受體配體活性等方式，參與細胞因子介導的信號通路、對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、對活性氧的反應、對無機物的反應、對氧化應激的反應、對有毒物質的反應、對細胞外刺激的反應、細胞對氧化應激的反應、對細菌的反應等生物進程。

圖4 關鍵靶點GO富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路富集分析發現，28 個關鍵靶點顯著富集在111 條通路上。根據P值選取富集結果排名前30 的信號通路可視化，見圖5。并利用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制靶點-通路網絡圖，見圖6。

圖5 土茯苓-川牛膝治療GA前30條富集通路氣泡圖

圖6 靶點-通路網絡圖

3 討論

中國古代醫家多將痛風歸屬于“痹證”“歷節”等范疇。現代醫家多認為痛風屬本虛標實之證，當責之于“濕、熱、瘀”等病理因素，治療時應以清熱利濕、活血通絡為法［10-14］。“土茯苓-川牛膝”藥對為臨床治療痛風常用中藥［15］，可清熱除濕，利尿活血。目前尚缺乏“土茯苓-川牛膝”藥對治療GA的作用機制的相關實驗研究。

本研究發現，作用于關鍵靶點的藥效成分中，槲皮素、柚皮苷等成分作用的關鍵靶點個數相對較多。槲皮素可抑制黃嘌呤氧化酶活性并促進尿酸排泄，進而降低血尿酸濃度［16-17］，同時其能夠抑制MSU 誘導的白細胞募集、TNF-α 和IL-1β的產生、炎癥反應的激活、NF-κB 的激活和炎癥成分mRNA 的表達［18］。柚皮苷等類黃酮化合物具有抗氧化、抗炎癥等作用［19］。因此預測“土茯苓-川牛膝”藥對治療GA 的重要藥效成分可能為槲皮素、柚皮苷等。

本研究通過篩選共得到28 個關鍵靶點，PPI網絡顯示“土茯苓-川牛膝”藥對治療GA 的各靶點之間關系密切，其中自由度較高且與痛風疾病關系緊密的靶點分別為IL-6、MAPK3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）、TNF、CASP3（caspase-3，CASP3）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、PTGS2（prostaglandin g/h synthase 2，PTGS2）、IL-1β、CCL2（C-C motif chemokine 2，CCL2）等。IL-6 是多功能炎癥細胞因子，研究表明，痛風急性發作期患者血清及關節液中IL-6含量呈明顯升高狀態［20］。TNF分子有TNF-α 和TNF-β兩種形式，可激活中性粒細胞，促 進 其 表 達IL-1、IL-6 等 細 胞 因 子［20-21］。MAPK1 和MAPK3 為MAPK 基因成員，為重要的炎癥評價指標，可通過減少氧自由基、抑制細胞增殖及促凋亡等，降低炎性反應［22-23］。IL-1β能激活IL-1受體，可促進炎性趨化因子及其他炎癥調節因子的表達，誘導中性粒細胞進入尿酸鹽沉積的關節炎性部位［21，24］。CASP3 在細胞凋亡的執行階段起著關鍵作用，其調控凋亡過程的關鍵調節位點，并進一步激活下游信號通路從而引起細胞凋亡［25］。PTGS2 屬于誘導性即刻反應基因，主要參與炎癥和有絲分裂過程，在炎癥過程中發揮著重要作用［26］。CCL2為趨化誘導細胞因子，可趨化炎性細胞向炎癥部位聚集，并誘導IL-2、IL-6 等炎性因子的表達［27］。

本研究對28 個關鍵靶點進行了GO 功能和KEGG 通路富集分析，富集結果顯示“川牛膝-土茯苓”藥對治療GA 作用機制涉及了多種生物學過程和多條信號通路。其中，GO 富集分析結果提示關鍵靶點主要通過細胞因子受體結合、調節細胞因子活性、受體配體活性等方式參與細胞因子介導的信號通路、應對氧化應激、活性氧、脂多糖等生物進程。KEGG通路富集結果顯示，與GA相關性高的通路為IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、Th17 細胞分化等。其中，IL-17 參與了人體內大量的炎性反應，在炎性疾病的發生及發展過程中發揮著至關重要的作用。研究發現，急性GA 大鼠IL-17 的表達水平顯著增高［28］。另外，有學者發現，痛風患者血清IL-17處于高表達狀態，IL-17陽性組痛風患者發病病程更長，受累關節數目更多，IL-6 水平更高［29］。TNF-α 是一種重要的免疫調節和前炎性因子，其參與的IL-1 活化過程、IL-6 介導的炎癥反應，以及NF-κB 炎癥信號通路等均為炎癥反應的重要環節。TNF 可誘發或加重GA 的病理過程，并參與GA慢性期的骨質破壞過程，是GA發生發展的重要炎癥因子［30］。研究表明，TNF-α 與GA 的發生、發展及預后密切相關［31］。楊西超等［32］研究表明，急性期痛風患者血清TNF-α 水平顯著高于緩解期患者。Thl7 細胞與多種自身免疫性疾病的發病機制有關，主要分泌IL-17、IL-21、IL-6 等細胞因子，參與炎癥反應的多個環節，同時，Th17 細胞的分化需要TGF-β、IL-6、IL-21、IL-23等細胞因子的參與［33］。周麗雅等［34］研究發現，藥物干預GA大鼠可使Th17含量降低，炎性因子IL-17、IL-6 水平隨之降低，大鼠炎癥反應減輕。楊虹等［35］發現，痛風患者外周血中Th17 細胞可增多且伴隨調節性T 細胞減少，提示Th17/調節性T 細胞比例失衡可能參與痛風炎癥及免疫反應，在痛風免疫炎癥機制中發揮重要作用。Toll 樣受體信號通路是固有免疫經典信號通路，也是GA 極為重要的炎癥信號通路之一。GA 發生過程中，TLR 受體識別尿酸鈉，激活固有免疫并趨化中性粒細胞，釋放細胞因子，產生爆發式級聯擴增反應，激活炎癥信號通路，最終引發痛風急性炎癥［36］。近些年，NOD 樣受體在固有免疫介導的炎癥反應中發揮的作用越來越被重視，其中，NLRP3 炎癥小體是不可忽視的重要蛋白。NLRP3 是NOD 樣蛋白受體家族中的重要成員，可識別并結合如尿酸鹽晶體等危險信號，通過活化caspase-1、促進炎性因子釋放等促進炎癥反應的進行［27］。研究發現，痛風疾病發生的必要條件是NLRP3 以及凋亡相關斑點樣蛋白的參與，否則炎癥不會發生，此研究進一步證明了NLRP3 在GA 發生發展過程中起到了關鍵的作用［37］。張志明等［38］研究表明，急性痛風患者的NLRP3 mRNA 表達水平高于緩解期痛風患者。由此可見，GA 疾病的發生過程涉及多個靶點，有多個生物學過程以及多條通路的參與，“川牛膝-土茯苓”藥對可能通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Th17 細胞分化、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路等發揮抗炎、調控細胞凋亡、抗氧化應激等功能，進而起到治療GA的作用。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學對“土茯苓-川牛膝”藥對治療GA 的作用機制進行預測，發現其主要通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、Th17細胞分化等途徑發揮抗炎、調控細胞凋亡、抗氧化應激等作用治療GA，抑制炎癥反應，這體現了中醫藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的特點。同時預測結果與已知實驗結果相吻合，提示本研究所預測的靶點和通路具有可行性，為進一步研究“土茯苓-川牛膝”藥對治療GA 的作用機制提供理論基礎和科學依據。