中藥梔子治療IgA 腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究?

龐欣欣，王學(xué)藝，朱 清，商海濤，彭紫凝，韓佳瑞△

1 河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046

IgA 腎病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，也是慢性腎臟病和終末期腎臟病的主要病因［1］。IgAN的病理特征是在腎小球系膜區(qū)以IgA 沉積為主，臨床表現(xiàn)為血尿，可伴有蛋白尿、高血壓和腎功能受損等表現(xiàn)［2-3］。IgAN 的發(fā)病機制尚不清楚，有關(guān)IgAN的多種假說尚不能解釋IgA 沉積相關(guān)的腎損害，目前的治療方法尚不能阻斷IgAN 的進(jìn)展［4-5］，約15%～40%的患者在確診十年內(nèi)發(fā)展成終末期腎病［6］。

中醫(yī)藥對IgAN 的治療有獨特的優(yōu)勢。IgAN中醫(yī)辨證大多為本虛標(biāo)實、虛實夾雜。濕熱證是IgAN的重要證型［7-8］。梔子味苦性寒，入心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，主治熱病心煩、黃疸尿赤、血淋澀痛、熱毒瘡瘍等。藥理研究表明，梔子有抗炎、抑制氧化應(yīng)激、降低膽固醇和低密度脂蛋白、改善血管內(nèi)皮功能紊亂等作用［9］。國醫(yī)大師張琪教授在辨治IgAN 尿血時，對辨證屬瘀熱互結(jié)或腎陰虧虛者，在經(jīng)驗方中均用梔子清熱解毒［10］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘梔子治療IgAN 的有效成分及作用靶點，同時構(gòu)建梔子有效作用靶點與IgAN 疾病靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測梔子治療IgAN 的相關(guān)靶點。進(jìn)一步對這些靶點進(jìn)行疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析、基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，為梔子治療IgAN 的作用靶點和機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對梔子有效成分的篩選通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）挖掘梔子的所有化學(xué)成分，根據(jù)各個成分的吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion），即ADME（absorption、distribution、metabolism、excretion）參數(shù)篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，藥物相似性（drug like，DL）＞0.18［11］。

1.2 梔子的作用靶點和lgAN的相關(guān)靶點檢索采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以“Gardeniae Fructus”為關(guān)鍵詞預(yù)測篩選梔子有效成分作用靶點。GeneCards是公共集成數(shù)據(jù)庫，提供了來自約150個網(wǎng)絡(luò)來源的以人類基因為中心的全面基因注釋和預(yù)測信息，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、遺傳信息學(xué)、臨床基因信息等［12］。以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞在Gene Cards 里篩選與IgAN有關(guān)的所有靶點，并在TTD、DrugBank、DisGeNET、GAD 等數(shù)據(jù)庫中篩選補充［13］。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）是數(shù)據(jù)挖掘的重要途徑。應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用該數(shù)據(jù)庫構(gòu)建梔子作用靶點與IgAN靶點的交集PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點［14］。篩選參數(shù)設(shè)置主要有：生物機體選擇為人類，最低要求交互分?jǐn)?shù)設(shè)置最高置信度0.4。

1.4 梔子治療lgAN 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的可視化基于梔子和IgAN 的蛋白互作靶點數(shù)據(jù)，引入梔子可作用于IgAN 的有效成分，提取兩者交集，采用Cytoscape 3.7.2 軟件把這些數(shù)據(jù)制作成可視化網(wǎng)絡(luò)圖，其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點之間的關(guān)系，挖掘其相互之間的作用關(guān)系。即得到梔子治療IgAN 的疾病-藥物-分子-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 和KEGG 富集分析DAVID 數(shù)據(jù)庫廣泛應(yīng)用于基因注釋，可通過該數(shù)據(jù)庫挖掘基因與疾病的相關(guān)性。GO 分析是生物學(xué)領(lǐng)域中用于基因產(chǎn)物細(xì)胞功能、分子功能和生物功能的分類的系統(tǒng)，可以通過DAVID 工具進(jìn)行GO 富集分析。同時，應(yīng)用DAVID工具對梔子和IgAN交集蛋白靶標(biāo)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到梔子治療IgAN的主要作用通路。GO和KEGG富集分析，考察梔子的潛在靶標(biāo)可能具有的生物學(xué)功能，參與的生物學(xué)通路［15］。校正統(tǒng)計學(xué)超幾何分布定量（P.adjust值）來評估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學(xué)功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust 值在圖中顏色越紅，則顯著性越強。

2 結(jié)果

2.1 梔子有效成分的ADME分析檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中梔子的所有成分，按照OB＞30%和DL＞0.18進(jìn)一步篩選出梔子有效成分15個。見表1。

2.2 梔子的作用靶點和lgAN 的相關(guān)靶點檢索結(jié)果通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找到15 個有效成分，其中，只有12 個有效成分具有相對應(yīng)的靶點，對這12 個有效成分進(jìn)行靶點基因注釋，刪去重復(fù)靶點，得到95個有效預(yù)測藥物靶點。在GeneCards、TTD、DrugBank 等數(shù)據(jù)庫中篩選IgAN 相關(guān)靶點，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，共得到1346 個與疾病相關(guān)的靶點。取梔子和IgAN的有效靶點交集，得到41個共同靶基因。見圖1。

圖1 梔子活性成分有效靶基因與IgAN相關(guān)靶基因

2.3 梔子-lgAN作用靶點蛋白互作關(guān)系分析取梔子和IgAN的有效靶點交集，得到41個梔子-IgAN相互作用靶點。采用STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 分析，得到352條PPI關(guān)系。取其中富集節(jié)點數(shù)目最多的前30 個靶點，做出柱狀圖，得到前30 個梔子-IgAN 核心靶點。其中橫軸為富集節(jié)點數(shù)目，縱軸為靶點基因名稱。核心靶點主要有炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子、蛋白激酶、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子等。見圖2—3。

圖2 梔子與IgAN的PPI關(guān)系圖

圖3 梔子治療IgAN的核心作用靶點

2.4 梔子治療lgAN網(wǎng)絡(luò)可視化分析通過Cytoscape 軟件進(jìn)行梔子治療IgAN 的網(wǎng)絡(luò)的疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析。納入上述PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選的41 個基因和分析篩選，得到9 個梔子可用有效成分，同時在網(wǎng)絡(luò)中加入疾病和藥物使網(wǎng)絡(luò)圖更加直觀。網(wǎng)絡(luò)可視化圖，見圖4。

圖4 梔子-IgAN-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 梔子治療lgAN 的機制分析對梔子和IgAN交集蛋白靶標(biāo)基因采用DAVID 工具進(jìn)行GO 分析，得到梔子可治療IgAN 的作用靶點的生物學(xué)功能77 種，綜合分析后取前10 種功能特性，得到梔子有效成分靶點主要通過這些生物學(xué)功能特性治療IgAN，如DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、泛素連接酶結(jié)合性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合性、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性等。再采用DAVID 工具進(jìn)行KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)梔子治療IgAN信號通路有120條，綜合分析后取前20條信號通路。KEGG分析顯示，梔子治療IgAN的有效靶點主要在晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）-受體（receptor of AGEs，RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等。其中氣泡或柱形圖顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強，氣泡大小越大或柱形越長，則該生物學(xué)功能或該通路富集的靶點越多。根據(jù)排名，找到這些靶點最關(guān)鍵的AGEs-RAGE 信號通路圖，同時用紅色表示梔子靶點在該信號通路上具體作用點，見圖5—7（所有結(jié)果均符合P.adjust＜0.05）。

圖5 梔子治療IgAN的相關(guān)生物學(xué)功能

圖6 梔子治療IgAN關(guān)鍵信號通路

圖7 AGEs-RAGE信號通路圖

3 討論

含有IgA1 的免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積是IgAN 的特征性病理表現(xiàn)［16-17］。30%～40%的IgAN患者發(fā)展為進(jìn)行性腎功能下降，需要在診斷后二十年內(nèi)進(jìn)行腎臟替代治療。IgAN 發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無有效治療藥物來阻斷病情的進(jìn)展［18］，因此，探索中醫(yī)藥治療IgAN的手段至關(guān)重要。

中醫(yī)中并無IgAN 的病名記載，根據(jù)臨床表現(xiàn)，可歸于“尿血”“水腫”“腰痛”“虛勞”“腎風(fēng)”等疾病范疇［19］。羅登貴等［8］運用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)整理了八十余位中醫(yī)名家治療IgAN 的經(jīng)驗文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)風(fēng)熱、濕熱、氣虛、陰虛是本病的關(guān)鍵病機，涼血止血、活血化瘀、益氣滋陰、清熱利濕、清熱解毒、補益脾腎為主要治法。劉童童等［20］分析了469 例IgAN 患者濕熱證與臨床病理的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)濕熱證的程度與IgAN 患者臨床病理的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，濕熱證是IgAN 重要的中醫(yī)病機。濕性趨下，易侵襲下焦，阻滯氣機運行，影響臟腑氣化，濕性黏滯，易造成IgAN 的纏綿難愈，濕與熱合，如油入面，難解難分，濕欲下行而熱留之，熱欲上行而濕阻之，使疾病更加遷延難愈［21］。“治濕熱之法，以清熱利小便為最好”，梔子清熱利濕，瀉火解毒，切中IgAN病機。

梔子對IgAN 治療作用所涉及的靶點和機制目前尚不完全清楚。龐欣等［22］發(fā)現(xiàn)，梔子苷通過調(diào)節(jié)NLRP3來減輕IgAN模型小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)地預(yù)測了梔子作為IgAN 的潛在分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，梔子作用機制涉及多通路、多靶點。本研究篩選梔子入血的活性成分15個，模擬預(yù)測95個有效作用的靶點和352 個相互作用關(guān)系，“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，包括梔子對藏紅花酸、槲皮素、山奈酚、豆甾醇等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點，比如白細(xì)胞介素6、血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、有絲分裂原活化蛋白激酶、表皮生長因子受體等靶點。而通過針對梔子治療IgAN 的有效成分靶點進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)梔子主要通過以下這些生物學(xué)功能特性治療IgAN，如DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、泛素連接酶結(jié)合性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合性、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性等。

本研究進(jìn)一步針對關(guān)鍵靶點進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示，梔子治療IgAN 最關(guān)鍵的通路為AGEs-RAGE信號通路。AGEs-RAGE信號通路作用廣泛，可激活下游核轉(zhuǎn)錄因子κB，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB異常高表達(dá)并進(jìn)入細(xì)胞核，與多種基因啟動子特異性序列結(jié)合，引起大量黏附分子、生長因子、促炎細(xì)胞因子等的表達(dá)和釋放，引起組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙［23-24］。AGEs-RAGE 促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子1 的產(chǎn)生，增強單核細(xì)胞趨化蛋白1 的表達(dá)，最終造成腎臟組織纖維化［23］。因此，梔子可作用于AGEs-RAGE 下游相關(guān)通路中的多個靶點從而發(fā)揮治療作用，但目前尚無AGEs-RAGE在IgAN治療中的相關(guān)研究，可作為未來研究的方向進(jìn)一步研究。

綜上所述，梔子治療IgAN 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、泛素連接酶結(jié)合性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合性、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合性等生物學(xué)特性，并涉及AGEs-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號通路。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析能有效地揭示梔子治療IgAN 可能的作用機制，為后續(xù)進(jìn)一步臨床和實驗研究設(shè)計等提供重要的理論依據(jù)，也為IgAN 的治療指明了新的方向。