基于綠豆發狀根的快速CRISPR/Cas9基因編輯方法

閆強 胡亞群 薛冬 周琰琰 丁佩 韋雅雯 袁星星 陳新

摘要：由于缺乏有效穩定的遺傳轉化體系，導致基因編輯技術在綠豆中的應用受到極大限制，也使綠豆基因功能研究受到極大阻礙。因此，建立一套基于發根農桿菌的操作簡便、快速且高效的綠豆嵌合植株轉化技術，可以為綠豆基因功能研究提供技術支撐。首先在CRISPR/Cas9載體骨架中插入1個綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）表達框用于陽性發狀根的快速篩選，然后將含有靶標基因gRNA的CRISPR/Cas9質粒導入發根農桿菌K599。菌液注射侵染綠豆幼苗植株下胚軸，評價K599在綠豆中誘導發狀根發生及CRISPR/Cas9系統在綠豆轉基因發狀根組織中的效率。結果顯示，K599菌液侵染種植7d的綠豆幼苗植株并在保濕條件下培養3周可在侵染點誘導發狀根產生，此嵌合植株在切除原生根后可在霍格蘭培養液中正常生長且培養1周后即可用于后續檢測。用GFP篩選的結果顯示，陽性發狀根占比約為（57.8±10.0）%。隨機選擇15個熒光檢測陽性的轉基因發狀根組織，利用測序檢測靶位點的編輯效果，結果顯示有10個靶位點的序列發生了突變，突變比例達到67%，其中堿基缺失突變9個，堿基轉換突變1個。由本研究結果可知，利用該方法可以在無菌組織培養的條件下于4周內獲得目的基因編輯的轉基因組織，極大地便利了綠豆分子水平上的功能研究，也為其他尚缺乏穩定遺傳轉化體系的作物進行基因功能研究提供了參考。

關鍵詞：綠豆；CRISPR/Cas9；基因編輯；發狀根轉化；遺傳轉化；綠色熒光蛋白

中圖分類號：S522.01文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0048-06

綠豆是我國傳統的雜糧作物，其種子含有豐富的人體易消化蛋白、纖維、維生素B和多種礦物微量元素等營養成分，同時還具有清熱解毒、消炎殺菌等藥理作用，是一種備受消費者喜歡的藥食同源類食用豆類作物［1-2］。綠豆由于其生育期短（60～75d）、抗逆性強及共生固氮的能力，是輪作和救災備荒的優良作物。近年來，隨著我國農業供給側結構調整和人民生活水平的不斷提高，綠豆在滿足人們日益增長的健康多元化飲食的需求及精準扶貧、產業結構調整、鄉村振興中發揮著重要作用。

基于序列特異性核酸酶的基因組編輯技術在過去10年內發展迅速，并徹底改變了生命科學研究的各個領域［3］。與早期開發的鋅指核酸酶（ZFNs）技術和類轉錄因子效應物核酸酶（TALENs）技術相比，規律成簇的間隔短回文重復相關蛋白技術（CRISPR/Cas9）利用1個向導RNA（gRNA）對靶基因位點進行特異性識別，并在Cas9蛋白作用下對靶點DNA進行切割，斷裂的DNA雙鏈通過非同源末端連接、同源重組方式進行修飾，在此過程中實現對靶點序列的編輯［4］。CRISPR/Cas9系統由于載體構建簡單、編輯效率高等優點，已被作為一種便捷有效的工具而廣泛應用，目前在幾十種模式植物和作物中的應用均有相關報道［5-7］。在豆科植物中，CRISPR/Cas9系統已經成功用于百脈根、大豆、苜蓿、豇豆的基因編輯［8-11］。但在綠豆中，CRISPR/Cas9介導的基因編輯目前尚沒有相關報道。

目前，主流方案是利用農桿菌將包含CRISPR/Cas9元件的質粒通過遺傳轉化的方法導入宿主細胞［3］。雖然已有研究發現，用綠豆的初生葉片、下胚軸等作為外植體成功獲得了轉基因株系，并對侵染條件、培養基激素配方進行了積極探索［12-14］，但是這些報道的方法仍存在效率低、可重復性差的問題，綠豆的遺傳轉化在國內尚沒有成功的報道。由此可見，缺乏成熟高效的遺傳轉化方法是限制CRISPR/Cas9基因編輯技術在綠豆中應用的關鍵限制因素。

為了建立一套快速便捷的綠豆基因編輯技術體系，本研究擬探索發根農桿菌介導的嵌合植株轉化技術在綠豆中的適用性，并對CRISPR/Cas9系統在轉基因發狀根組織中的編輯效率進行評價，從而為綠豆基因功能研究提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

蘇綠1號綠豆種植在裝有蛭石和營養土混合物（體積比為2∶1）的小花盆中，澆水后放置在溫室中培養，培養條件設置為光—暗周期16h—8h，溫度為26℃。種植第3天澆水，培養7d待真葉剛剛展開時用于農桿菌侵染。

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）育苗后移栽到上述同樣營養土中，并在相同條件下培養5～6周用于外源基因的瞬時表達。試驗材料在2021年3—7月分批播種于江蘇省農業科學院植物智能生長室內。

1.2載體構建

利用在線軟件CRISPR（http：//crispor.tefor.net/crispor.py）在Vradi03g01240基因第1個外顯子區域選擇gRNA。首先將gRNA及其反向互補序列分別融合在引物U6-gRNA-F、U6-gRNA-R的5′端，并在引物pSCM-U6-F、pSCM-U6-R的5′端分別融合質粒pSCNcoⅠ上游、XbaⅠ下游同源序列。然后以pGmU6質粒為模板，用pSC-U6-F/U6-gRNA-R、U6-gRNA-F/pSC-U6-R2對引物搭配擴增，獲得大小分別為500、200bp的片段，最后利用諾維贊多片段重組試劑盒將片段與NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切線性化的pSC質粒重組，獲得載體pSC-gRNA。為便于陽性發狀根的篩選，以pBIN-GFP4載體為模板，用引物GFP-F/GFP-R擴增包含CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）閱讀框、終止子的完整表達框，并通過同源重組的方法分別插入pSC-gRNA的BstEⅡ位點處，至此完成載體pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP的構建，其中pSC-GFP作為空載體對照。載體構建過程中所用的引物序列見表1。

1.3綠豆發狀根的轉化

將質粒pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP通過凍融法轉入發根農桿菌K599感受態細胞中，利用引物pSC-seq-F/RPCR擴增驗證陽性克隆。將陽性克隆在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中于28℃、200r/min培養36h；待菌液渾濁后，吸取200μL菌液均勻涂布在加有卡那霉素的LB平板上并在28℃培養箱中過夜培養；第2天用涂布棒收集菌體至10mmol/LMgCl2溶液（含有40mg/L乙酰丁香酮）中，并調節D600nm至0.5～0.6。

綠豆幼苗培養7d時，待真葉完全展開后用于發根農桿菌侵染。首先用手術刀在子葉節處往下劃1個長約1cm的傷口，然后用移液器往傷口處滴加適量侵染菌液。將侵染處理完畢的植株放置于用透明塑料布做成的密封罩中，并保持罩內濕度在90%以上。每日檢查罩內濕度情況直至發狀根長出2～5cm，從侵染傷口處往下約1cm處用剪刀將植株莖剪斷，將剪下的植株放置于霍格蘭營養液中繼續培養。此時得到的嵌合植株由非轉基因的莖、葉片及含有部分轉基因發狀根組織組成。待根長至5～7cm時，在宏觀熒光變倍顯微鏡下進行熒光篩選，并用鑷子小心去除無GFP的根，然后將此嵌合植株放回培養基中繼續培養用于后續試驗。

1.4DNA的提取和編輯位點的序列分析

利用基因組提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取轉pSC-GFP-gRNA質粒發狀根組織的基因組。用特異性引物Test-F/R擴增包含gRNA在內的附近基因組片段，將獲得的片段電泳驗證后送擎科生物技術有限公司進行測序。獲得相應序列后利用ClustalX軟件進行多序列比對并利用GeneDoc進行可視化處理。

1.5煙草葉片的瞬時表達和熒光觀察

將質粒pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP通過凍融法轉入根癌農桿菌GV3101感受態細胞中，經菌落PCR驗證后在含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平的液體LB培養基中于28℃、200r/min條件下培養48h；在4000r/min離心5min收集菌體，用10mmol/LMgCl2溶液（含有40mg/L乙酰丁香酮）清洗3遍后調節D600nm至0.5～0.6。用1mL注射器將侵染液注射進煙草葉片中，將處理過的植物放回培養室繼續培養48h后用于熒光觀察。切取注射區域煙草葉片置于共聚焦顯微鏡下，在488nm波長激發光下觀察熒光并拍照。

2結果與分析

2.1GFP標記的綠豆基因CRISPR/Cas9載體的構建

用在線軟件CRISPR在Vradi03g01240基因第1個外顯子區域49～68個核苷酸處設計gRNA（圖1-A），將gRNA片段插入載體pSC-IAA14上并進一步完成pSC-GFP-IAA14載體的構建，此載體由大豆GmU6啟動子驅動gRNA表達，同時含有1個由大豆GmUbi3啟動子驅動的dpCas9表達框及用于熒光篩選的CaMV-35S驅動的GFP表達框（圖1-B）。

為了驗證插入CRISPR載體中的GFP表達框是否能夠正常表達，用煙草瞬時表達系統對GFP信號進行檢測。結果顯示，將pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP在煙草葉片中瞬時表達后，均能夠觀察到強烈的熒光信號（圖2），說明改造的載體中的GFP能夠在植物體內正常表達。

2.2綠豆嵌合植株的獲得

從圖3-A至圖3-I可以看出，用含有pSC-GFP-gRNA載體的發根農桿菌K599在綠豆幼苗子葉節處進行侵染，結果顯示，誘導產生了發狀根組織。保濕處理1周后，侵染點組織變得明顯膨大（圖3-E）；保濕處理2周后，侵染位點繼續膨大并形成瘤狀的愈傷組織（圖3-F）；保濕處理3周后，侵染點處陸續有發整根形成（圖3-G）；待大部分根長至2～5cm時，從侵染傷口處往下約1cm處用剪刀將植株莖剪斷，剪下的植株置于霍格蘭營養液

中繼續培養（圖3-H）。待根長至5～7cm時（圖3-I），在宏觀熒光變倍顯微鏡下進行熒光篩選，并用鑷子小心去除無GFP的根（圖4）。經統計，發出綠色熒光的發狀根比例約為（57.8±10.0）%，然后將處理完畢的植株放回培養基中繼續培養，進行進一步的檢測，此植株具有野生型的莖、葉器官，發狀根組織為轉基因部分。

2.3轉基因發狀根組織基因編輯效果檢測

為了檢測獲得的嵌合植株發狀根組織中Vradi03g01240基因是否被成功編輯。隨機選擇15個熒光檢測陽性的轉化pSC-GFP-gRNA發狀根組織提取基因組DNA。用特異性引物Test-F/R擴增gRNA附近序列，結果顯示，對照和敲除的轉基因組織均擴增出了符合預期大小為706bp的條帶（圖5）。對條帶進行測序的結果顯示，15個獨立的轉基因事件中，有10個gRNA附近序列發生了突變，突變比例約為67%（圖6）。突變類型表現如下：小片段的堿基缺失9個，占突變總數的90%；堿基轉換突變1個，占突變總數的10%。以上結果表明，本研究中使用的CRISPR/Cas9系統可以對綠豆基因進行有效的編輯，創制多樣性的突變類型。

3討論與結論

CRISPR/Cas9基因編輯技術是目前應用廣泛的基因編輯技術，為基因功能研究和作物改良提供了大量突變材料［15-17］。本研究在前人基礎上，將應用于大豆基因編輯的遺傳轉化載體進行了進一步優化［18］，添加了GFP篩選標記，以便后續的陽性轉基因材料篩選鑒定。本研究以綠豆Vradi03g01240基因為目的基因進行基因編輯載體的構建，通過對熒光篩選過的發狀根組織進行測序分析，發現CRISPR/Cas9基因編輯的效率達到67%，其中90%的靶標基因gRNA區域發生了缺失突變。本研究結果充分證明了該CRISPR/Cas9系統在綠豆發狀根

系統中的適用性。

基于發根農桿菌介導的根毛轉化體系目前已被廣泛用于難以轉化或尚缺乏有效穩定轉化技術手段的植物進行基因功能驗證［19］。發根農桿菌K599介導的發狀根轉化技術在豆科作物大豆、菜豆、豇豆中都得到了成功的利用［11，20-21］。發狀根瞬時轉化技術能夠對候選基因進行快速的功能驗證，本系統在4周內即可獲得用于試驗的轉基因材料，而且熒光篩選結果表明陽性轉基因發狀根比例達到50%以上。穩定轉化雖然具有更加穩定的遺傳背景和一致的表型，但往往需要一年甚至更久才能拿到轉基因材料，尤其目前綠豆尚缺乏行之有效的穩定轉化技術體系。本研究證明了CRISPR/Cas9系統能夠在綠豆體內進行有效的基因編輯，創制大量的目的基因突變類型，發狀根轉化技術目前可作為研究綠豆基因功能的一個優異替代方案。本研究的方案能夠大大提高綠豆根系發育、根瘤形成、鹽堿非生物脅迫以及根部病蟲害等相關分子機制研究的速度和質量。

致謝：感謝南京農業大學喻徳躍教授惠贈pGmU6、pSC基因編輯載體，南京農業大學竇道龍教授惠贈pBIN-GFP4載體。

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