仔豬腹瀉大腸桿菌耐藥性和超廣譜β-內酰胺酶基因檢測分析

方光遠 談福利 張智敏 單星月 袁光蘇 王喜國 陳俊紅 胡志華 蔣加進 戴鼎震

摘要：為研究20日齡左右仔豬腹瀉發病機理，檢測仔豬腹瀉大腸桿菌耐藥性和超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）基因種類，分析仔豬腹瀉大腸桿菌耐藥特性，為獸醫臨床更好地預防控制仔豬腹瀉大腸桿菌病提供參考，從腹瀉發病仔豬糞便中分離出34株致病性仔豬腹瀉大腸桿菌，用10種頭孢類抗生素藥敏紙片對其進行藥物敏感試驗，并設計針對ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9的特異性引物，檢測34株仔豬腹瀉大腸桿菌ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9存在情況。藥敏試驗結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對10種頭孢類抗生素的敏感度不同，其中，對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛的耐藥率為68%、65%和56%，敏感率為29%、15%和35%；對頭孢哌酮、氨曲南的耐藥率為15%、9%，敏感率為70%、79%。ESBLs基因檢測結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，檢出率為100%；檢測到1株細菌具有CTX-M-9耐藥基因，檢出率為2.8%。由于該養豬場分離出的仔豬腹瀉大腸桿菌對頭孢類抗生素普遍耐藥，并且全部檢測出ESBLs的TEM基因，因此建議對養豬場的頭孢類抗生素使用應定期進行耐藥性檢測和合理規范使用。

關鍵詞：仔豬腹瀉大腸桿菌；耐藥性；超廣譜β-內酰胺酶基因；檢測與分析

中圖分類號：S852.6文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0053-04

大腸桿菌對頭孢菌素產生耐藥性的主要機理是產生超廣譜β-內酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）。ESBLs是通過質粒介導使細菌對第3、4代頭孢菌素（主要包含頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢吡肟等）及單環類內酰胺抗生素氨曲南和青霉素類抗生素產生耐藥的一組酶［1-2］。自從19世紀80年代歐洲國家發現并報道了第1例產ESBLs菌株后，目前已發現由質粒介導的ESBLs基因亞型200多種，其中，TEM（Temoniera）、SHV（Sulphadrylvariable）和CTX-M（Cefotaxime）基因型非常普遍［2-3］。根據基因同源性的差異把ESBLs分成三大類：TEM型、SHV型、非TEM非SHV型，其中，TEM型和SHV型占大多數。最近，伴隨CTX-M型不斷增加，且本來屬于2d亞類β-內酰胺酶OXA型中又出現了多種ESBLs，所以又把ESBLs分類為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型、其他5種類型［4-5］。ESBLs最常見的基因型是TEM，至今已有168種，全球廣泛分布。目前，我國濫用抗生素現象非常普遍，對超廣譜β-內酰胺酶的研究較晚，抗生素產生耐藥性的現象比較普遍。本試驗通過檢測仔豬腹瀉大腸桿菌超廣譜β-內酰胺酶基因型種類，分析仔豬腹瀉大腸桿菌的耐藥機理，為獸醫臨床提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗時間：2021年12月10日至2022年4月10日；地點：金陵科技學院動物科學與食品工程學院獸醫微生物實驗室。

1.1.1病料南京某養豬場34份仔豬腹瀉糞便［3］。

1.1.2菌株34份腹瀉仔豬糞便進行細菌分離培養獲得34株細菌，經鑒定均為仔豬腹瀉大腸桿菌［3］，凍干保存備用。

1.1.3試劑瓊脂糖、2×TaqPCRmix、DL2000DNAMarker等購自南京擎科生物有限公司；普通營養瓊脂平板、SS瓊脂平板、普通營養肉湯等自行配制。

1.2方法

1.2.1細菌復蘇純化培養取保存的34株仔豬腹瀉大腸桿菌凍干菌種，接種普通營養瓊脂平板、SS瓊脂平板和普通營養肉湯，放入培養箱內培養。

1.2.2細菌藥敏試驗購自杭州濱河微生物試劑有限公司10種頭孢類抗生素藥敏紙片為頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁和氨曲南。藥敏試驗采用常規紙片法進行。菌液制備：挑選普通營養瓊脂平板上分離培養好的大腸桿菌菌落置于滅菌的0.9%氯化鈉溶液中，制成均勻懸液，使其濁度與0.5麥氏單位比濁管濁度一致。用滅菌棉簽蘸取制備好的菌液，均勻涂布整個平板表面。用滅菌鑷子夾取藥敏紙片1張，貼在平板表面，1塊平板上貼4種不同的藥敏紙片，各藥敏紙片間間隔≥30mm，且紙片距平板邊緣≥15mm。操作完成的平板放入恒溫培養箱中37℃24h后，仔細觀察，并測量各藥敏紙片抑菌圈直徑。結果判定參考《抗微生物藥物敏感試驗執行標準（CLSI-M100-S20）》。

1.2.3細菌超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因檢測

1.2.3.1細菌ESBLs耐藥基因PCR擴增引物根據已發表文獻的ESBLsTEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因序列，設計合成TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9上下游引物（表1）。

1.2.3.2細菌DNA模板制備及ESBLs耐藥基因PCR檢測取各仔豬腹瀉大腸桿菌營養肉湯培養物1mL，4℃10000r/min離心3min，去除上清，加生理鹽水1mL搖勻；再同上離心洗滌1次，棄上清液，取1mL生理鹽水加入管中搖勻，作為細菌DNA模板。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環；然后72℃延伸10min［3-6］。PCR基因片段檢測：用1倍TBE緩沖液配備1.2%瓊脂凝膠100mL，加入5μLGoldview倒板冷卻后，取各PCR產物10μL加樣后電泳。電泳儀設定電壓120V、電流130mA、時間45min，電泳后采用紫外檢測儀觀察結果。

2結果與分析

2.1細菌復蘇純化培養結果與分析

在普通營養瓊脂平板上分區劃線接種34株仔豬腹瀉大腸桿菌菌種凍干粉，37℃培養24h后，菌落均生長良好，呈圓形、濕潤、無色半透明狀菌落［4-6］（圖1）。SS瓊脂平板上生長出圓形、光滑的紅色菌落［4-6］（圖2）。營養肉湯中呈均勻、渾濁狀態，底部出現黏性沉淀物，液面管壁出現菌環。

2.2細菌藥敏試驗結果與分析

由表2結合《抗微生物藥物敏感試驗執行標準（CLSI-M100-S20）》的判斷標準可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢西叮、氨曲南10種抗生素的敏感度不同，其中，對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛的耐藥率比較高，分別為68%、65%和56%，敏感率比較低，分別為29%、15%和35%，這可能與臨床使用上述3種抗生素較多有關；對頭孢哌酮、氨曲南的耐藥率比較低，分別為15%和9%，敏感率比較高，分別為70%和79%，這可能與臨床使用上述2種抗生素較少有關。

2.3細菌耐藥基因檢測結果與分析

34株仔豬腹瀉大腸桿菌菌株超廣譜β-內酰胺酶TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因片段PCR檢測結果表明，其中34株仔豬腹瀉大腸桿菌均被檢測到超廣譜β-內酰胺酶TEM基因片段，7號菌株細菌被檢測到CTX-M-9基因片段，其他基因片段未被檢測到。

2.3.1TEM耐藥基因檢測結果與分析由圖3、圖4可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌均檢測到TEM耐藥基因，該耐藥基因檢出率為100%。

2.3.2CTX-M-9耐藥基因檢測結果與分析

由圖5、圖6可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌7號菌株被檢測到CTX-M-9耐藥基因，該耐藥基因檢出率為2.8%。

3討論

頭孢類抗生素是獸醫臨床抗細菌感染治療中最常應用的抗生素，隨著3代頭孢類抗生素的大量應用，細菌對頭孢類抗生素耐藥現象越來越嚴重，細菌對此類藥物耐藥的很大一部分因素是產生β-內酰胺酶和ESBLs。TEM型耐藥基因是ESBLs中最常見的基因型，至今已有168種，呈全球性分布，也是我國最常見的ESBLs［7］。本試驗結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，陽性率為100%；檢測到1株CTX-M-9耐藥基因，檢測率為2.8%。Kawamura等報道，TEM可水解羧芐西林、苯唑西林或頭孢菌素；SHV具有水解頭孢噻肟巰基的功能；CTX-M對頭孢噻肟水解作用很大，對頭孢他啶水解作用很小［8］。根據本試驗藥敏試驗和耐藥基因檢測結果可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對10種抗生素耐藥性和敏感性情況差別較大，但檢測出CTX-M-9耐藥基因的7號菌株對頭孢噻肟的耐藥性明顯比其他未檢測出的菌株高。34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，說明該豬場仔豬腹瀉致病性大腸桿菌對頭孢類抗生素均已經產生耐藥，應重視。由于檢測的仔豬腹瀉大腸桿菌菌株數較少，檢測出的ESBLs基因類型也較少，仔豬腹瀉大腸桿菌具體的耐藥特性和ESBLs基因分布狀況有待更進一步探索。

參考文獻：

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［6］方光遠，張莉，陸宇超，等.犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性檢測［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（9）：273-277.

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