蘋果MdPYL9基因對蘋果組培苗耐鹽性的影響

劉銘瀟 井俊麗 李曉涵 孫曄 徐繼忠 周莎莎

摘要：以MdPYL9過表達的和未轉基因（對照）的GL-3蘋果組培苗為試驗材料，在含有0、100、150mmol/LNaCl的MS培養基中培養15d，通過觀察鹽脅迫下過表達、未轉基因組培苗表型的變化，測定相對電導率（REL）、保護酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）］活性、丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子（O-2·）含量、滲透調節物質（脯氨酸、可溶性蛋白）含量等生理指標及蘋果抗鹽相關基因表達量的變化，旨在探究MdPYL9基因對蘋果組培苗耐鹽性的影響。結果表明，處理15d后，對照、轉基因蘋果組培苗在100、150mmol/LNaCl處理下均出現鹽脅迫癥狀，但轉基因組培苗的癥狀較輕，對照植株的癥狀較重。鹽處理后轉基因組培苗中的MDA含量、相對電導率、超氧陰離子（O-2·）含量總體呈上升趨勢，且顯著低于對照。轉基因組培苗中滲透調節物質可溶性蛋白在100mmol/LNaCl處理下最高，脯氨酸含量逐漸上升，并且顯著高于對照。轉基因蘋果組培苗中SOD、POD、CAT活性在100mmol/LNaCl處理下最高，顯著高于對照中的SOD、POD、CAT活性。熒光定量PCR分析結果表明，鹽處理后，蘋果抗鹽相關基因MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1在轉基因組培苗中表達量顯著高于對照。由研究結果可以看出，MdPYL9基因的過表達可在一定程度上提高組培蘋果苗的耐鹽性。

關鍵詞：蘋果；MdPYL9基因；組培苗；耐鹽性

中圖分類號：S661.101文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0149-06

蘋果（MalusdomesicaBorkh.）是世界主栽果樹之一，我國的蘋果種植面積和產量占世界的一半以上，居世界首位［1］。土壤鹽漬化可造成果樹樹體營養不良、葉片發黃和產量下降等問題，是限制蘋果產量的一個重要因素［2］，已被認為是干旱、半干旱地區和廣大灌區農業生產發展中的一個重要阻礙，并且已經受到越來越多的關注［3］，全球已有約7%陸地遭受到鹽堿化的脅迫，而且這個比例依然在不斷提高。我國是土壤鹽堿化問題嚴重的國家，鹽堿化土壤面積一望無垠、分布廣泛，不利于區域農業的發展［4］。由于蘋果的遺傳背景較為復雜，并且育種周期較長，通過傳統雜交方法很難獲得結合所有最佳品質的品種［5］。因此，盡快探索挖掘蘋果脅迫基因，提高蘋果的抗逆性，確保其在惡劣環境下也能增產，對于加快我國蘋果產業的發展具有重要意義［6］。

脫落酸（ABA）作為植物激素，在植物生長發育的任何階段都有舉足輕重的地位，也與植物中干旱、鹽分和其他逆境脅迫反應有關，因而被稱為逆境激素［7］。有研究發現，通過基因工程提升ABA含量或加強ABA信號通路，可以提升植物對干旱、高濃度鹽等非生物脅迫的抵抗力［8］。2009年，利用基因篩選和酵母雙雜交的方法在擬南芥細胞中發現ABA受體PYR/PYL/RCAR（簡稱PYLs）［9-11］，其主要功能是辨別ABA信號和傳輸啟動信號［12］。有研究發現，AtPYL9與擬南芥抗旱有關［13］，OsPYL9在水稻胚乳中特異性表達，提高了對ABA的敏感［14］。小麥TaPYL9對脫落酸敏感，可能參與了小麥對高鹽、干旱脅迫響應的調控［15］。本研究對前期獲得的MdPYL9基因過量表達的蘋果GL-3組培苗進行抗鹽性研究，分析MdPYL9對蘋果抗鹽性的調控機制，以期為蘋果抗逆育種研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗于2022年4月2日至5月30日在河北農業大學園藝學院生物技術實驗室進行，試驗材料為繼代25d且生長良好、長勢均一致的MdPYL9基因過表達蘋果組培苗和非轉基因GL-3組培苗。

1.2試驗方法

1.2.1試驗處理選擇生長、長勢一致的組培苗，每瓶2株，每個處理接種12瓶，設置3次重復，分別接種于含有0、100、150mmol/LNaCl的繼代培養基中，于24℃光照培養。處理15d后觀察表型并拍照、收集葉片，用液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱中存儲待測。

1.2.2生理生化指標的測定用氮藍四唑（NBT）法［16］測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，用紫外吸收法［16］測定過氧化氫酶（CAT）活性，用愈創木酚法［16］測定過氧化物酶（POD）活性，用考馬斯亮藍G-250染色法［17］測定可溶性蛋白含量，用硫代巴比妥酸法［17］測定丙二醛（MDA）含量，用酸性茚三酮染色法［17］測定脯氨酸含量。相對電導率參考李銀峰的方法［18］測定。

1.2.3RNA提取和qRT-PCR表達的定量分析植物總RNA的提取使用聚合美RNA分離試劑盒（M5PlantRNeasyComplexMiniKit，北京，中國），按照說明書進行操作。測定反轉錄得到的cDNA核酸樣品濃度后，用ddH2O將cDNA全部稀釋成200ng/μL。用LightCycler96熒光定量儀進行qRT-PCR分析，分析抗鹽相關基因MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1表達量的變化。本研究所用引物序列見表1。

1.2.4數據處理與分析用Excel對數據進行處理，用IBMSPSSStatistics23.0進行統計分析，用單因素方差分析（ANOVA）方法進行Duncans多重比較檢驗，α=0.05。

2結果與分析

2.1鹽脅迫下對照和轉基因組培苗表型的變化

如圖1-a所示，在0mmol/LNaCl處理下，轉基因蘋果組培苗和對照植株生長情況基本一致。用100mmol/LNaCl處理15d后，轉基因組培苗和對照植株都出現鹽脅迫癥狀，但轉基因蘋果組培苗葉片的褐斑數量比對照少。用150mmol/LNaCl處理15d后，轉基因組培苗癥狀較輕，對照植株的癥狀更加嚴重。隨著鹽處理濃度的增加，各株系的MDA含量均在100mmol/LNaCl處理下達到最高，在150mmol/LNaCl處理下有所下降，總體呈上升趨勢，但上升程度不同，0mmol/LNaCl處理轉基因植株與對照株系的MDA含量沒有顯著差異，但是在用100、150mmol/LNaCl處理后對照MDA含量顯著高于轉基因株系，并且差異顯著（圖1-b）。由圖1-c可以看出，隨著鹽濃度的增加，植株的相對電導率（REL）逐漸上升，并且不同處理間差異顯著。

2.2超氧陰離子（O-2·）含量、保護酶活性的變化

由圖2-a可以看出，用0mmol/LNaCl處理15d后，對照和轉基因組培苗的超氧陰離子含量無顯著差異，鹽脅迫處理后，對照和轉基因組培苗中超氧陰離子含量均有不同程度的上升，在150mmol/LNaCl處理下含量達到最高，對照組培苗中超氧陰離子含量顯著高于轉基因組培苗。從圖2-b、圖2-c中可發現，鹽脅迫15d后，在0mmol/LNaCl處理下，對照和轉基因組培苗的SOD、POD活性無顯著差異，100mmol/LNaCl處理組的SOD、POD活性最高，并且轉基因組培苗的SOD、POD活性顯著高于對照。由圖2-d可知，鹽脅迫15d后，對照、轉基因組培苗的CAT活性在100mmol/LNaCl處理下最高，在150mmol/LNaCl處理下，CAT活性有所下降，在0mmol/LNaCl處理下，轉基因組培苗的CAT活性顯著低于對照，但鹽脅迫處理后CAT活性顯著高于對照。

2.3滲透調節物質含量的變化

從圖3-a可以看出，用0mmol/LNaCl處理15d后，對照和轉基因組培苗的可溶性蛋白含量差異不顯著，但在100mmol/LNaCl鹽脅迫下，對照和轉基因幼苗的可溶性蛋白質含量增加，轉基因組培苗的可溶蛋白含量顯著高于對照。在150mmol/LNaCl處理下，對照和轉基因幼苗的可溶性蛋白含量較0mmol/L處理也增加，但對照和處理組兩者之間沒有顯著差異。從圖3-b可以看出，處理15d后，0mmol/LNaCl處理的對照和轉基因組培苗的脯氨酸含量無顯著差異，鹽脅迫處理后，對照和轉基因組培苗中的脯氨酸含量均有不同程度的上升，在150mmol/LNaCl處理下最高，并且轉基因組培苗中

的脯氨酸含量顯著高于對照。

2.4蘋果抗鹽相關基因表達量的變化

由圖4-a至圖4-d可以看出，用150mmol/LNaCl處理15d后，MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1基因的相對表達量在各轉基因組培苗中顯著上調，轉基因組培苗內各基因的相對表達量顯著高于對照。

3討論與結論

鹽脅迫會抑制植物的生長和發育，改變植株形態、影響植株生理生化和代謝特征，對植物生長不利［19］。本研究結果表明，在0mmol/LNaCl處理下，對照和轉基因組培苗的表型差異不明顯，在鹽脅迫后都出現了受損害的現象。與100mmol/LNaCl處理相比，在150mmol/LNaCl處理后受傷害特征更加明顯。但是在相同脅迫時間內，對照植株葉面褐斑和壞死現象比轉基因更多。細胞中的MDA含量反映了膜脂過氧化的程度，相對電導率反映了細胞膜的通透性。相對電導率和MDA含量的變化都會在一定程度上影響植物細胞膜的完整性及對不利脅迫的反應損傷程度［6］。用100、150mmol/LNaCl處理后，植株中MDA含量和相對電導率顯著提高，表明MdPYL9基因過表達緩解了鹽脅迫下生物膜的受損傷程度。

鹽脅迫會使植物體內活性氧含量增加，使植物體中細胞的結構受到損害［20］。本研究中，在0mmol/LNaCl處理中對照和轉基因組培苗超氧陰離子含量沒有顯著性差異，鹽脅迫后都有不同程度上升，但對照植株中超氧陰離子含量更多，表明對照植株受到的氧化脅迫更加嚴重，轉基因在一定程度上緩解了由鹽脅迫引起的氧化脅迫。植物可以觸發抗氧化防御系統來清除過量的活性氧，并保護細胞不受到氧化脅迫［21］。有試驗表明，鹽脅迫下植物體內的SOD、POD活性升高，高鹽害下植物體內的SOD、POD活性反而降低［22］。本研究結果顯示，用100mmol/LNaCl處理后，對照和轉基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性都有所升高，但是轉基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性顯著高于對照株系。在150mmol/LNaCl處理下，對照和轉基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性都有所下降，轉基因組培苗中的SOD、CAT活性顯著高于對照，POD活性沒有顯著差異。酶活性在100mmol/LNaCl處理下最高，在150mmol/LNaCl處理下有所下降，可能由于植物在中、低鹽濃度條件下的應激反應表現為酶活性的升高，鹽濃度過高會對植物組織產生過強的迫害。

在鹽脅迫條件下，植物細胞中的蛋白質合成代謝活性增強，使植物自身能夠合成更多的蛋白質參與滲透壓調節，從而提高植物對鹽脅迫環境的適應能力［23-24］。閻艷霞等在對棗的研究中發現，鹽處理后棗葉中可溶性蛋白含量隨著NaCl濃度的增加而增加［25］。八棱海棠可溶性蛋白含量隨鹽含量的增加表現為先上升后下降最后上升的趨勢［26］。在本試驗中，對照和轉基因組培苗的可溶性蛋白質含量在0mmol/LNaCl處理下沒有顯著差異，鹽處理后表現為先升高后降低的趨勢。轉基因組培苗中的可溶性蛋白含量的增幅大于對照，說明轉基因組培苗具有更強的抑制細胞失水的能力，有較高的耐鹽能力。眾多研究結果表明，植物體內的脯氨酸含量均隨外界鹽濃度的增加而升高［27-29］。ZmHDZ10轉基因植株中脯氨酸含量的增加提高了其對干旱和鹽脅迫的耐受性［30］。在本試驗中，未添加NaCl處理的對照和轉基因組培苗中脯氨酸含量沒有顯著差異，鹽脅迫后脯氨酸含量上升，轉基因組培苗中的脯氨酸含量高于對照。研究結果表明，MdPYL9通過調節脯氨酸的積累來調節蘋果植株的耐鹽性。在本試驗中，通過分析從滲透調節物質可知，轉基因植株的耐鹽性更強。前人研究發現，鹽脅迫會導致植物滲透調節失衡和產生離子毒害，擬南芥細胞膜上的SOS1轉運蛋白是Na+/H+逆向轉運蛋白，NHX為液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白，過表達該基因會增強植物的抗鹽性［31］。SOS2、SOS3能夠調控SOS1的表達，也能夠響應鹽脅迫［32］。在150mmol/LNaCl處理下，轉基因組培苗中MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1基因的表達量顯著高于對照，因此推測MdPYL9可能參與了調控MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1的表達來調節植物耐鹽性。以上研究結果表明，MdPYL9基因在提高蘋果植株的抗鹽性方面發揮著一定作用，過表達MdPYL9基因后蘋果植株對鹽脅迫的耐受性增強。

參考文獻：

［1］崔家升，李曉萍.世界蘋果種植概況與我國蘋果生產前景展望［J］.北方果樹，2012（4）：1-3.

［2］玉米提·哈力克，塔依爾江·艾山，張利霞，等.柯柯牙城郊防護林主要造林類型土壤改良效應研究［J］.新疆大學學報（自然科學版），2015，32（3）：258-264，250.

［3］郭全恩.干旱地區果樹對土壤鹽漬化脅迫的響應機制［D］.楊凌：西北農林科技大學，2006.

［4］李建國，濮勵杰，朱明，等.土壤鹽漬化研究現狀及未來研究熱點［J］.地理學報，2012，67（9）：1233-1245.

［5］周瑞金，張傳來.蘋果轉基因研究進展［J］.廣西農業科學，2009，40（1）：71-75.

［6］馬夢楠，劉媛，馬鋒旺，等.蘋果MdGH3-2/12在鹽脅迫下的功能分析［J］.干旱地區農業研究，2021，39（6）：39-52.

［7］王宏，藺經，李曉剛，等.鹽脅迫下的杜梨PbPYL4基因克隆及其與PbNCED2基因表達分析［J］.果樹學報，2014，31（6）：1017-1023.

［8］馬宗桓，陳佰鴻，李文芳，等.葡萄PYL基因家族的鑒定與表達分析［J］.果樹學報，2018，35（3）：265-274.

［9］ParkSY，FungP，NishimuraN，etal.Abscisicacidinhibitstype2CproteinphosphatasesviathePYR/PYLfamilyofSTARTproteins［J］.Science，2009，324（5930）：1068-1071.

［10］MiyazonoK，MiyakawaT，SawanoY，etal.Structuralbasisofabscisicacidsignalling［J］.Nature，2009，462（7273）：609-614.

［11］MaY，SzostkiewiczI，KorteA，etal.RegulatorsofPP2Cphosphataseactivityfunctionasabscisicacidsensors［J］.Science，2009，324（5930）：1064-1068.

［12］KrasenskyJ，JonakC.Drought，salt，andtemperaturestress-inducedmetabolicrearrangementsandregulatorynetworks［J］.JournalofExperimentalBotany，2012，63（4）：1593.

［13］ZhaoY，ChanZL，GaoJH，etal.ABAreceptorPYL9promotesdroughtresistanceandleafsenescence［J］.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2016，113（7）：1949-1954.

［14］ChenZQ，KongL，ZhouY，etal.Endosperm-specificOsPYL8andOsPYL9actaspositiveregulatorsoftheABAsignalingpathwayinriceseedgermination［J］.FunctionalPlantBiology，2017，44（6）：635-645.

［15］徐園園，趙鵬，劉冬梅，等.小麥ABA受體基因TaPYL9的克隆和表達分析［J］.河南農業科學，2020，49（7）：18-24.

［16］高峻鳳.植物生理學實驗指導［M］.北京：高等教育出版社，2006：211-218.

［17］王學奎.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京：高等教育出版社，2006：134-204.

［18］李銀峰.轉AtCBF3基因蘋果株系對鹽堿及重金屬脅迫的響應［D］.保定：河北農業大學，2014.

［19］BaathGS，ShuklaMK，BoslandPW，etal.IrrigationwatersalinityinfluencesatvariousgrowthstagesofCapsicumannuum［J］.AgriculturalWaterManagement，2017，179：246-253.

［20］MudgalV，MadaanN，MudgalA.Biochemicalmechanismsofsalttoleranceinplants：areview［J］.InternationalJournalofBotany，2010，6（2）：136-143.

［21］辛苗苗.蘋果質膜內在水通道蛋白基因MdPIP2；5的克隆和功能分析［D］.楊凌：西北農林科技大學，2021.

［22］于瑋瑋，曹波，龍鴻，等.新疆野蘋果幼苗對鹽脅迫的生理響應［J］.華北農學報，2016，31（1）：170-174.

［23］鄒琦.植物生理學試驗指導［M］.北京：中國農業出版社，2000：163-166.

［24］常麗麗，彭存智，王丹，等.鹽芥葉片應答鹽脅迫的蛋白質組學分析［J］.江蘇農業學報，2022，38（1）：49-64.

［25］閻艷霞，王玉魁，張東.不同棗品種對NaCl脅迫的適應性研究［J］.河南農業大學學報，2008，42（4）：398-401.

［26］曾麗蓉，鄭鑫，張婷，等.四種蘋果砧木耐鹽性差異比較［J］.天津農業科學，2015，21（3）：105-109.

［27］KumarSG，ReddyAM，SudhakarC.NaCleffectsonprolinemetabolismintwohighyieldinggenotypesofmulberry（MorusalbaL.）withcontrastingsalttolerance［J］.PlantScience，2003，165（6）：1245-1251.

［28］Santa-CruzA，AcostaM，RusA，etal.Short-termsalttolerancemechanismsindifferentiallysalttoleranttomatospecies［J］.PlantPhysiology&Biochemistry，1999，37（1）：65-71.

［29］張云起，劉世琦，楊鳳娟，等.耐鹽西瓜砧木篩選及其耐鹽機理的研究［J］.西北農業學報，2003，12（4）：105-108.

［30］ZhaoY，MaQ，JinXL，etal.Anovelmaizehomeodomain-leucinezipper（HD-Zip）Igene，Zmhdz10，positivelyregulatesdroughtandsalttoleranceinbothriceandArabidopsis［J］.PlantandCellPhysiology，2014，55（6）：1142-1156.

［31］ShiHZ，QuinteroFJ，PardoJM，etal.TheputativeplasmamembraneNa+/H+antiporterSOS1controlslong-distanceNa+transportinplants［J］.ThePlantCell，2002，14（2）：465-477.

［32］曲常志.蘋果MdMYB4基因表達載體構建，愈傷轉化及抗鹽性鑒定［D］.泰安：山東農業大學，2017.