HDAC2基因多態性與噪聲性聽力損失易感性的關聯

徐婭冬, 李雅麗, 黃魏寧

(1北京市東城區第一人民醫院耳鼻喉科, 北京 100075; 2衛生部北京醫院耳鼻喉科, 北京 100005)

噪聲性聽力損失(Noise-induced hearing loss,NIHL)是勞動者長期暴露于噪聲環境引起的一種感音神經性聽力損失性疾病,據統計全世界范圍內約1/10的人口由于長期暴露于噪聲作業環境存在NIHL風險[1]。研究顯示,當暴露于相同的噪聲作業環境時,僅部分個體發生NIHL,且聽力損失的程度也表現出個體差異[2]。有學者指出,對相同環境條件下表現聽力損失差異的原因可能與易感性基因突變有關[3]。組蛋白修飾是調控基因表達的重要機制之一,組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是催化完成組蛋白修飾的重要酶,HDACs參與調控細胞增殖、遷移等多種細胞生物學過程相關基因的轉錄。組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)是HDACs成員之一,在哺乳動物多種細胞中均有表達,尤其在耳蝸組織中廣泛表達[4]。研究發現[5],突發性感音神經性聽力損失(Sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)患者HDAC2呈現低表達,與患者治療時糖皮質激素抵抗有關。另有研究發現[6],茶堿能夠通過維持HDAC2表達減輕慶大霉素誘導的耳蝸毛細胞毒性,提示HDAC2與感音神經性聽力損失有關。HDAC2基因存在多個基因多態性(SNP)位點,萬瑾凌[7]發現HDAC2基因的rs2810164和rs538681位點基因突變與精神分裂癥易感性有關;王冉等[8]研究顯示HDAC2基因的3個SNP位點與男性酒精使用認知功能有關。本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法探究HDAC2基因SNP位點與從事噪音作業工人發生NIHL風險的關聯,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年6月-2022年6月北京市東城區第一人民醫院耳鼻喉科確診的246例NIHL患者為觀察組,按照1∶1匹配選取同時期246例聽力未損傷者為對照組。納入標準:(1)NIHL符合2014版《職業性噪聲聾的診斷》[9]中的相關標準,即雙耳高頻聽閾>25 dB;(2)從事噪聲作業者,工齡3年以上;(3)個體之間無血緣關系。排除標準:(1)中耳炎、耳膜穿孔等其他耳病病史;(2)顱腦損傷、腮腺炎、耳毒藥物服用史、家族性耳聾等其他可能引起耳聾的病因者;(3)作業場所存在爆震、高溫、重金屬等理化因素致聾者;(4)從事噪聲作業前已存在聽力損失者。本研究通過北京市東城區第一人民醫院倫理委員會審批(批號:19093),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料的收集 采用問卷調查法收集所有研究對象的基本資料,包括:性別、年齡、吸煙史、飲酒史、近期有無耳毒藥物服用史、家族耳聾病史及其他疾病史;噪聲暴露情況,包括噪聲暴露時間、工作中有無接觸理化有害物質。共發放與回收有效問卷均492份。

1.2.2 純音聽力檢測[10]測試均由同一位專業人員測量,所有研究對象測試前脫離噪聲作業≥48 h,采用AD226聽力計(丹麥Interacoustics)測試隔音室本底噪聲<25 dB,測量雙耳6個頻率純音氣導聽閾值(0.5、1、2、3、4、6 KHz),測試結果依據GB/T 7582-2004進行調整。

1.2.3 作業噪聲測量[11]根據國家衛生健康委員會GBZ/T 189.8-2007要求,采用Noise pro多功能噪聲劑量計(美國QUEST)測量,將傳感器放置于工人耳部高度,對向聲源方向測量,取多個采樣點測量8 h等效連續A聲級,計算累積噪聲暴露量以評價實際的噪聲暴露強度。

1.2.4 HDAC2基因多態性檢測 樣本采集及DNA提取:采集所有受試者空腹靜脈血2 mL,置于抗凝管中混勻,3 000 r/min離心12 min獲取上清液,PE管分裝,采用全血基因組DNA快速提取試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)提取基因組DNA。基因分型:采用PCR-RFLP檢測外周血HDAC2 SNP位點,按照PCR擴增試劑盒(美國Thermo Fisher公司)說明書操作進行目的基因擴增,獲得PCR產物,引物序列見表1。回收PCR產物,進行RELP檢測,設定反應體系:PCR產物4.0 μL,緩沖液1.0 μL,限制性內切酶(北京藍博斯特生物技術有限公司)1.0 μL,ddH2O 9 μL,37℃水浴2 h酶切,進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物基因型。

表1 HDAC2基因SNP位點PCR引物序列

2 結果

2.1 觀察組與對照組基線資料及噪聲暴露情況比較觀察組與對照組在年齡、性別分布、吸煙史、飲酒史、噪聲暴露時間、噪聲暴露強度方面比較,差異無統計學意義(P>0.05);與對照組比較,觀察組高頻聽閾升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 觀察組與對照組基線資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗多態性測序結果顯示,HDAC2基因的SNP位點(rs10499080、rs12208304、rs6568819、rs1320445和rs3757016)均存在3種基因型(野生型、雜合型及純合型);經Hardy-Weinberg平衡檢驗,5個SNP位點均具有群體代表性(P>0.05),見表3。

表3 PAPP-A、PPAR-γ基因多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 觀察組與對照組HDAC2基因多態性比較觀察組與對照組HDAC2基因rs12208304、rs1320445和rs3757016位點基因型分布及等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05);觀察組與對照組HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點基因型分布比較,差異均有統計學差異(P<0.05);與對照組比較,觀察組rs10499080和rs6568819位點T等位基因頻率升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 觀察組與對照組HDAC2基因多態性比較/例(%)

2.4 HDAC2基因多態性與NIHL易感性Logistic回歸分析Logistic回歸分析表明,以HDAC2基因SNP位點野生型基因為參照,rs12208304、rs1320445和rs3757016位點各基因型患者發生NIHL的風險無明顯增加(P>0.05);rs10499080位點TT基因型[OR(95%CI)=1.659(1.120～2.694)]及隱性模型CT+TT基因型[OR(95%CI)=1.944(1.120～3.217)]NIHL風險增加(P<0.05);顯性模型CC+CT基因型[OR(95%CI)=0.731(0.535～0.917)]NIHL風險降低(P<0.05);rs6568819位點患者TT基因型[OR(95%CI)=3.108(1.531～8.731)]及隱性模型CT+TT基因型[OR(95%CI)=1.510(1.031～2.536)]NIHL風險增加(P<0.05);顯性模型CC+CT基因型[OR(95%CI)=0.892(0.420～0.954)]NIHL風險降低(P<0.05),見表5、圖1。

圖1 HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點Logistic回歸分析森林圖

表5 HDAC2基因多態性與NIHL易感性Logistic回歸分析

3 討論

職業損害調查顯示,噪聲暴露不良作業環境時導致聽力損傷的主要環境因素,合并基礎疾病者也易發生聽力損傷[12-13]。NIHL發生機制不僅與噪聲暴露的環境有關,還與易感性基因突變有關,在相同噪聲暴露條件下,聽閾偏倚的最大與最小值相差可達70 dB,說明個體之間存在聽力損失易感性的差異[14]。個體之間存在多個NIHL易感性基因,如粒狀頭樣2(GRHL2)[15]、胱天蛋白酶激活與募集結構域8(CARD8)[16]等。關于NIHL遺傳多樣性的報道也逐漸增多,多態性基因涉及氧化應激、毛細胞凋亡等多種機制,如超氧化物歧化酶rs2855116位點、GRHL2基因rs1981361位點等,為探尋NIHL發病原因提供了豐富思路[17]。

研究顯示,噪聲暴露能夠誘導工人及動物模型發生聽力損傷相關基因表達變化,提示噪聲與表觀遺傳效應存在一定關聯[18]。組蛋白修飾是表觀遺傳改變的重要途徑,HDAC2作為HDACs家族重要成員,參與組蛋白去乙酰化過程,該過程與聽力損失關系密切。已有報道發現,HDAC2基因存在多個SNP位點,且證實SNP位點與強迫癥、糖尿病等多種疾病的發生有關[19-20]。本研究發現,觀察組與對照組HDAC2基因rs12208304、rs1320445和rs3757016位點基因多態性無差異,且經Logistic回歸分析證實上述3個位點與NIHL易感性無關,說明上述3個位點堿基突變并未引起該基因功能改變,可能與細胞自我修復有關。研究發現[21],SSNHL患者HDAC2 mRNA及蛋白表達水平較健康者降低,且糖皮質激素敏感SSNHL患者治療后HDAC2表達水平較耐藥患者顯著提高。周瓊瓊等[22]從動物實驗方面證實,脂多糖誘導的急性聽力損失豚鼠模型發生糖皮質激素抵抗與HDAC2有關,分析機制為,HDAC2能夠被募集至炎癥基因啟動子區促使其去乙酰化,從而抑制促炎基因表達,說明HDAC2與聽力損失關系密切。

本研究發現,HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點均發生堿基C→T突變,NIHL患者T等位基因頻率高于對照組,說明HDAC2基因的2個SNP位點(rs10499080和rs6568819)可能與NIHL有關。經Logistic分析發現,rs10499080和rs6568819位點的TT基因型及隱性模型CT+TT基因型NIHL風險增加,兩位點的顯性模型CC+CT基因型NIHL風險降低,提示攜帶隱性模型基因或T等位基因者NIHL風險較高,進一步證實HDAC2基因的兩個SNP位點與NIHL存在密切關聯。Wang等[23]通過構建NIHL小鼠模型發現小鼠聽力閾值與耳蝸毛細胞數量有關,分析發現染色盒同源物4(CBX4)基因突變能誘導耳蝸毛細胞凋亡,從而影響小鼠聽力。另有體外研究發現[24],噪聲暴露可導致耳蝸毛細胞ATP耗竭,ATP耗竭能夠導致組蛋白去乙酰化,最終導致毛細胞丟失。由此可分析HDAC2基因突變導致NIHL風險增加的原因為,一方面HDAC2基因突變可通過影響HDAC2表達而影響組蛋白去乙酰化,引起耳蝸毛細胞凋亡,從而導致聽力損失[25];另一方面HDAC2基因突變能對炎癥、氧化應激等與聽力損失相關基因啟動子區的去乙酰化過程產生影響,從而抑制相關基因表達,最終導致聽力損失風險增加[26]。

綜上所述,HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點堿基C突變為T的噪聲作業工人發生NIHL的風險較高,為臨床中預測職業環境聽力損失風險評估提供參考。本課題組在后續研究中會對HDACs家族其他基因之間及基因與環境之間是否存在交互作用進行深入研究,為保證職業健康提供更科學的依據。