基于UPLC-Q-TOF-MS和網絡藥理學探討絲穗金粟蘭水提物抗炎鎮痛藥效物質及作用機制

甄丹丹，黃耀斌，盧顯興，陳景敏，丘 琴，張 淼，史俊豪

基于UPLC-Q-TOF-MS和網絡藥理學探討絲穗金粟蘭水提物抗炎鎮痛藥效物質及作用機制

甄丹丹1，黃耀斌2#，盧顯興3，陳景敏4*，丘 琴1，張 淼1，史俊豪1

1. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530022 2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530200 3. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530200 4. 玉林市中醫醫院，廣西 玉林 537100

利用高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜法（UPLC-Q-TOF-MS）分析絲穗金粟蘭水提物的主要成分，并結合網絡藥理學的方法對其抗炎鎮痛藥效物質及作用機制進行預測分析。結合ChemSpider數據庫、mzCloud平臺及現有文獻研究，對目標化合物二級質譜特征碎片離子進行比對確認，鑒定絲穗金粟蘭水提物的化學成分；通過FAFDrug4數據庫篩選絲穗金粟蘭水提物的活性成分，運用Pharmmapper平臺和Uniprot數據庫預測絲穗金粟蘭的成分靶點，GeneCards平臺獲得相關疾病靶點，利用Venny平臺獲得成分和疾病的交集靶點；通過String數據庫和Cytoscape3.7.0軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，并篩選核心靶點，利用David數據庫對潛在的核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并構建“活性成分-靶點-通路”網絡。從絲穗金粟蘭水提物中共鑒定45個成分，包括有機酸類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、含氮類化合物；篩選出33種活性成分，活性成分與疾病交集靶點70個；通過PPI網絡篩選出核心靶點13個；富集分析顯示，絲穗金粟蘭主要參與蛋白磷酸酶結合、胰島素受體結合、蛋白激酶活性等功能，通過酪氨酸激酶受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥等通路抗炎鎮痛。通過對“活性成分-靶點-通路”網絡分析進一步得到5個關鍵靶點和8個關鍵活性成分。通過結合UPLC-Q-TOF-MS和網絡藥理學的方法闡明了絲穗金粟蘭是通過多成分、多靶點、多途徑發揮抗炎鎮痛的作用，為絲穗金粟蘭的進一步質量評價及藥理活性的研究提供參考。

絲穗金粟蘭；抗炎鎮痛；活性成分；藥效物質基礎；UPLC-Q-TOF-MS；網絡藥理學；木犀草素；綠原酸；新綠原酸；迷迭香酸；依斯坦布林A；莽草酸；石竹素；原兒茶酸

絲穗金粟蘭為金粟蘭屬植物絲穗金粟蘭(A. Gray) Solms-Laub的全草，有祛風散寒、活血止痛、解毒消腫的功效，適用于治療類風濕關節炎、跌打腫痛、慢性腸胃炎、瘡癤腫毒等。目前對其抗炎鎮痛藥效物質基礎的研究鮮有報道。中藥化學成分復雜，傳統的鑒別方法在未知成分的結構解析方面存在一定困難。液質聯用技術將液相與質譜的優勢相結合，可以快速分離和鑒定中藥中的復雜成分，在中藥的成分分析、質量控制及中藥血清藥物化學方面具有一定優勢[1]。網絡藥理學是大數據背景下的產物，融合了多門學科的概念和方法，通過構建“藥物活性成分-疾病-靶點”網絡，可以從整體上分析多成分中藥的作用機制。因此，廣泛運用于中藥或民族藥的研究中[2-3]。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術對絲穗金粟蘭水提物中的化學成分進行解析并采用網絡藥理學的方法對其抗炎和鎮痛潛在藥效物質及作用機制進行預測，為絲穗金粟蘭今后藥理活性及質量標準的研究提供數據支撐。

1 材料

1.1 藥材與試劑

絲穗金粟蘭采自廣西來賓市金秀縣，經廣西中醫藥大學朱意麟實驗師鑒定為金粟蘭屬植物絲穗金粟蘭(A. Gray) Solms-Laub的全草。乙腈和甲醇均為質譜純，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；水為超純水，購自美國默克公司；甲酸和乙酸銨均為質譜純，購自上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 儀器

TripleTOF 5600型高分辨質譜儀（美國SCIEX公司）；UltiMate 3000型超高效液相色譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取絲穗金粟蘭藥材剪碎成1 cm大小，稱取500 g，加入10倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，用醫療紗布濾過，合并2次濾液并濃縮成浸膏，精密稱取絲穗金粟蘭水提物浸膏250 mg，轉移置10 mL量瓶中并加入50%甲醇溶液，定容至刻度，超聲15 min，濾過后濾液經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；正離子模式流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），負離子模式流動相為2 mmol/L乙酸銨溶液（A）-乙腈（B）。正、負離子均梯度洗脫：0～1.5 min，5% B；1.5～2.5 min，5%～10% B；2.5～14 min，10%～40% B；14～22 min，40%～95% B；22～25 min，95% B；25～26 min，95%～5% B；26～30 min，5% B。體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

2.3 質譜條件

電噴霧離子源；霧化氣壓60 psi（1 psi＝6.895 kPa）；輔助氣壓60 psi；氣簾氣壓35 psi；溫度650 ℃；噴霧電壓5000 V（正離子模式）或?4000 V（負離子模式），在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質譜數據。一級采集范圍/50～1200，轟擊能量30 eV，每50毫秒采集10張二級譜圖。

2.4 絲穗金粟蘭活性成分和靶點篩選

將解析得到的絲穗金粟蘭成分上傳至FAFDrug4（fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr）數據庫進行活性成分的篩選[4]。

2.5 炎癥和疼痛的靶點篩選

將獲取的絲穗金粟蘭活性成分導入Pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）平臺預測潛在的作用靶點，使用UniProt（http://www.uniprot.org/）平臺進行校正。采用GeneCards（http://www.genecards.org/）平臺，分別以炎癥（inflammation）和疼痛（pain）為檢索詞，進行搜索，獲得疾病靶點，并分別取前10%作為候選靶點，利用Venny平臺獲得成分和疾病的交集靶點作為潛在抗炎和鎮痛的藥效靶點。

2.6 交集靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建及富集分析

將交集靶點上傳String（https://string-db.org/）數據庫，篩選條件為“Homo sapien”，置信度為0.9，構建PPI網絡。利用Cytoscape 3.7.0軟件中Network Analyer插件進行分析，獲取絲穗金粟蘭抗炎鎮痛的核心靶點，篩選條件為大于介數中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和度值這3項的平均值。利用David數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對潛在的核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.7 “活性成分-靶點-通路”網絡構建

將核心靶點、與核心靶點相關的活性成分、關鍵通路導入到Cytoscape 3.7.0軟件中，構建“活性成分-靶點-通路”網絡，并以高于BC、CC和度值這3項的平均值為條件篩選出核心成分。

3 結果

3.1 絲穗金粟蘭水提物成分分析

將絲穗金粟蘭水提物樣品按“2.2”“2.3”項下條件進行分析，得到絲穗金粟蘭水提物樣品在正、負離子模式下的總離子流圖，見圖1。采用Peakview1.2計算分子式，對比理論值和實際值，結合ChemSpider、mzCloud和維譜數據庫及現有文獻研究，從絲穗金粟蘭水提物中共推測了45個成分，其中有機酸25個、黃酮類3個、香豆素類7個、倍半萜5個、含氮類有機物5個，具體信息見表1。

圖1 正 (A)、負 (B) 離子模式下絲穗金粟蘭水提取物的總離子流圖

3.2 網絡藥理學預測分析

3.2.1 絲穗金粟蘭活性成分的篩選及藥效靶點的預測 基于UPLC-Q-TOF-MS的分析結果得到絲穗金粟蘭成分45種，經FAFDrugs4數據庫篩選，獲得33種主要活性成分（表1），包括綠原酸、新綠原酸、迷迭香酸等。將上述33種活性成分導入到Pharmmapper數據庫，并利用UniProt數據庫進行查詢，去重后共收集到457個靶點。

3.2.2 炎癥和疼痛相關靶點篩選 在GeneCards數據庫中檢索獲得與炎癥相關的靶點1090個，與疼痛相關的靶點1218個。與活性成分457個靶點匹配后，交集得到70個絲穗金粟蘭抗炎鎮痛的潛在作用靶點，見圖2。

表1 絲穗金粟蘭水提取物中化學成分的鑒定

a～e依次為有機酸類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、含氮類化合物

a—e are organic acids, flavonoids, coumarins, sesquiterpenes and nitrogenous compounds

圖2 絲穗金粟蘭活性成分-抗炎鎮痛靶點Venn圖

3.2.3 PPI網絡 將上述活性成分抗炎鎮痛的70個潛在作用靶點導入STRING數據庫平臺，得到由54個節點及182條邊組成的PPI網絡，見圖3，節點代表潛在作用靶點，圖中節點越大表示該節點度值越大。進一步應用Cytoscape 3.7.0軟件計算網絡節點的拓撲參數，度值、BC、CC的平均數依次為6.740、0.028、0.418，基于以上3個參數進行篩選，最終得到13個核心靶點，見表2。

3.2.4 GO功能富集分析 通過David數據平臺對13個核心靶點進行生物功能分析，以＜0.01為條件，共篩選得到189個GO條目，其中生物過程139條、細胞組成22條、分子功能27條。將生物過程、分子功能和細胞組成中排名前10的條目繪制成圖（圖4），基因數代表主要活性成分富集在該通路下的靶點數目。結果顯示，生物過程方面，絲穗金粟蘭活性成分主要參與蛋白磷酸酶結合、胰島素受體結合、蛋白激酶活性等；細胞組成方面，主要參與細胞核、線粒體、分子復合物等；分子功能主要涉及血小板激活、信號傳導、凋亡過程的負調控等。綜上所述，絲穗金粟蘭的活性成分可通過調控多種生物學途徑聯合發揮抗炎鎮痛作用。

圖3 PPI網絡

表2 核心靶點

圖4 GO功能富集分析 (前10)

3.2.5 KEGG通路富集分析 通過David數據平臺將潛在作用靶點與KEGG信號通路進行匹配，以＜0.01為篩選條件，共富集得到信號轉導Ras信號通路、酪氨酸激酶受體ErbB2信號通路、FoxO信號通路等128條。結合文獻研究，篩選出值最小的前16條信號通路進行后續研究，并繪制氣泡圖（圖5）。圖中節點越大，表示富集在這條通路上的靶點數量越多。

3.2.6 “活性成分-靶點-通路”網絡 將絲穗金粟蘭活性成分、潛在靶點、前16條KEGG通路導入到Cytoscape 3.7.0軟件，構建“活性成分-靶點-通路”網絡見圖6。該網絡共有62個節點，321條相互作用連線，其中紅色節點代表活性成分，共33個；黃色節點代表13個核心潛在作用靶點；紫色節點代表通路，共16條。節點越大，度值越高。應用Network Analyzer分析對網絡進行分析，活性成分的度值、BC、CC的平均數依次為6.727、0.004、0.501；關鍵靶點的度值、BC、CC的平均數依次為24.692、0.063、0.521。基于以上3個參數進行篩選，最終得到5個核心靶點，依次為蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen- activated protein kinase 14，MAPK14）、非受體酪氨酸激酶（sarcoma receptor coactivator，SRC）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和內糖苷酶F2；8個關鍵活性成分，分別為木犀草素、綠原酸、新綠原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、莽草酸、石竹素和原兒茶酸。通過分析網絡圖發現，絲穗金粟蘭活性成分中，同一活性成分能同時作用于多個靶點，而相同靶點亦對應多種活性成分，說明絲穗金粟蘭化學成分能夠多成分、多靶點發揮治療抗炎和鎮痛作用。

圖5 KEGG通路富集分析(前16)

圖6 “活性成分-靶點-通路”網絡

4 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS技術從絲穗金粟蘭水提物中解析出45種化學成分，其中有機酸25個、黃酮類3個、香豆素類7個、倍半萜5個、含氮類有機物5個。運用網絡藥理學的方法，本研究共篩選出絲穗金粟蘭水提物活性成分33個，與抗炎鎮痛相關的靶點70個，涉及AKT1、F2、MAPK14、SRC、EGFR、ErbB2、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、MAPK8等核心靶點，說明絲穗金粟蘭發揮抗炎和鎮痛作用具有多成分、多靶點的優勢。針對上述“活性成分-靶點-通路”網絡分析，發現原兒茶酸、木犀草素、綠原酸、新綠原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、莽草酸、石竹素8個活性成分在網絡中度值較大。研究表明，原兒茶酸可以抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6的分泌，對多數炎癥性疾病有一定治療作用[33-34]。綠原酸類成分是具有解熱、鎮痛、抗炎作用的一類成分，能夠通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/ 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路的激活，從而減輕炎癥的發生[35]。此外，綠原酸與AKT1、CASP3、F2、IGF1、MAPK14、MAPK8、磷脂酰肌醇-3激酶調節亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、SRC這8個靶點有關聯。此外，原兒茶酸也可以通過調節沉默信息調節因子1（SIRT1）/NF-κB途徑抑制脂多糖激活的BV2小膠質細胞的炎癥反應[36]。通過PPI網絡分析可知SRC、MAPK1、PIK3R1、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor 11，PTPN11）、MAPK8、EGFR、AKT1、IGF1在網絡中所占的度值較大，極可能為絲穗金粟蘭治療炎癥和疼痛性疾病過程中發揮重要作用的關鍵靶標。

為進一步研究絲穗金粟蘭抗炎鎮痛的潛在機制，對PPI網絡篩選出的13個核心靶點通路富集分析得到128個富集條目，其中ErbB信號通路、TNF信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等條目值顯著性較高（＜0.01），可能為其發揮抗炎鎮痛作用重要通路之一。TNF是一種促炎細胞因子，其異常分泌可導致炎癥的發生，研究表明可以通過調控TNF信號通路發揮抗炎鎮痛的作用[37]。免疫系統的細胞表達存在各種模式識別受體，這些受體在清除病原體時會存在無法區分自身和非自身分子，持續的TLR信號傳導會導致炎癥性疾病。TLR是最顯著的模式識別受體，其在對病原體感應時會引起炎癥反應，TLR拮抗劑的開發是目前免疫疾病研究的熱點[38]。本研究發現13個潛在靶點中有3個富集在Toll樣信號通路上，分別為MAPK8、MAPK1、AKT1、PIK3R1、MAPK14，可能為絲穗金粟蘭調控該通路的關鍵靶點。

綜上，絲穗金粟蘭可能通過原兒茶酸、木犀草素、綠原酸、新綠原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、隱綠原酸等33個成分調控SRC、MAPK1、PIK3R1、PTPN11、MAPK8、EGFR、AKT1、IGF等13個核心靶點進而影響ErbB信號通路、TNF信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等16條通路來發揮抗炎鎮痛作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-inflammatory and analgesic substances and mechanisms of aqueous extracts ofbased on UPLC-Q-TOF-MS and network pharmacology

ZHEN Dan-dan1, HUANG Yao-bin2, LU Xian-xing3, CHEN Jing-min4, QIU Qin1, ZHANG Miao1, SHI Jun-hao1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530022, China 2. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 4. Yulin Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yulin 537100, China

To analyze the main components of the aqueous extract ofby ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS), and predict its anti-inflammatory and analgesic potent substances and mechanisms by combining network pharmacology methods.Based on ChemSpider database, mzCloud platform and existing literature research, the secondary mass spectra of target compounds were compared and confirmed to identify the chemical composition of the aqueous extracts of. The active ingredients of the aqueous extracts ofwere screened by the FAFDrug4 database. The constituent targets ofwere predicted using the Pharmmapper platform and Uniprot database. The relevant disease targets were obtained using GeneCards platform, and the intersection targets of constituents and diseases were obtained using Venny platform. PPI network was constructed by using String database and Cytoscape 3.7.0 software, and the core targets were screened. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of potential core targets were performed by using David database, and “active ingredient-target-pathway” network was constructed.A total of 45 components, including organic acids, flavonoids, coumarins, sesquiterpenoids and nitrogen-containing compounds, were identified from the aqueous extracts of. A total of 33 active components were screened and 70 active components and disease intersection targets were identified. A total of 13 core targets were screened through PPI network. Enrichment analysis showed thatmainly participated in protein phosphatase binding, insulin receptor binding, protein kinase activity and other functions, and presented the effects of resisting inflammation and pain through tyrosine kinase receptor signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, tyrosine kinase inhibitor resistance and other pathways. Five key targets and eight key active components were further obtained through the analysis of the “active ingredient-target-pathway” network.By combining UPLC-Q-TOF-MS and network pharmacology, it is clarified thatplays an anti-inflammatory and analgesic role through multi-component, multi-target and multi-channel, which provides reference for further quality evaluation and pharmacological activity research of.

(A. Gray) Solms-Laub; anti-inflammatory and analgesic activity; active components; pharmacophore basis; UPLC-Q-TOF-MS; network pharmacology; luteolin; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; rosmarinic acid; istanbulin A; shikimic acid; epoxycaryophyllene; protocatechuic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)12 - 3903 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.017

2022-12-01

廣西中醫藥大學“桂派杏林青年英才”培養項目（2022C032）；中藥學廣西一流學科（桂教科研[2018]12號）；壯瑤藥協同創新中心（桂教科研[2013]20號）；廣西壯瑤藥重點實驗室（桂科基字[2014]32號）；廣西八桂學者中藥創新理論與藥效研究項目（J13162）；廣西重點學科壯藥學（桂教科研[2013]16號）；國家重點研發計劃資助項目（2019YFC1712300）

甄丹丹（1983—），女，碩士，助理研究員，從事中藥與藥學的科研與教學。E-mail: 8zhen@163.com

通信作者：陳景敏（1975—），女，本科，副主任護師，從事腦病臨床護理和醫院藥學工作。E-mail: 294363022@qq.com

#共同第一作者：黃耀斌（1983—），男，本科，主管中藥師，從事藥學科研和醫院藥學工作。E-mail: 350365847@qq.com

[責任編輯 李亞楠]