CRISPR/Cas9 基因編輯技術在玉米分子育種中的應用概述

尹祥佳 翟 琛 李 晶 南 銘 郝 楠

（1 蘭州職業技術學院，甘肅蘭州 730070；2 甘肅省農業科學院，蘭州 730070）

黨的二十大報告指出，要加快建設農業強國，扎實推動鄉村產業、人才、文化、生態、組織振興；2023 年中央一號文件明確提出，全面推進鄉村振興，加快農業農村現代化[1-2]。因此，要立足國情農情，要將實現具有中國特色的農業現代化作為全面建設社會主義現代化國家的重要組成和戰略支撐。農業現代化的基礎是種子，種業又是農業的“芯片”，是國家戰略性、基礎性核心產業，是推動我國農業跨越式發展的重要引擎[3]。國家統計局數據顯示，2022 年全國糧食播種面積11833.21 萬hm2，全國糧食總產量68652.8 萬t，其中玉米播種面積為4307.01 萬hm2，玉米產量是27720.3 萬t，分別占36.4%和40.4%，穩居我國糧食作物第1 位。

近年來，我國糧食總產量的連續增長得益于種業的發展和種子的貢獻度，種業的發展離不開種業科技創新的支撐[4]。隨著玉米全基因組測序技術的發展，全方位研究玉米基因功能及其應用是當前玉米分子育種研究的重要內容。CRISPR/Cas9 基因編輯技術具有易操作、效率高和擴展性強等顯著優點，已成為開展玉米基礎研究和應用研究最有力的遺傳操作方式[5]。我國科學家在CRISPR/Cas9 基因編輯技術的研發、精準開展玉米分子育種、獲得改良的玉米育種材料等方面取得了一定的突破[6]。通過闡述CRISPR/Cas9 基因編輯技術的研究歷程、類型和作用原理，概述CRISPR/Cas9 基因編輯技術在玉米分子育種中的應用，實現玉米育種材料的分子改良，不斷加強基因編輯作物監管，能夠為玉米分子育種研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術

1.1 CRISPR/Cas9 基因編輯研究歷程植物基因編輯技術是指以植物的特定功能基因為研究對象，采用基因編輯技術對這些特定基因的編碼序列進行特異編輯，對基因組中的靶位點進行敲除、替換、插入等定點人工修飾，進行分子改良，最終實現植物的優良性狀能夠穩定遺傳，經過基因組改造后的植物稱為基因編輯植物。基因編輯技術有鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR/Cas9）[7]。TALENs 和CRISPR/Cas9 相繼入選2012年、2013 年《科學》十大科學突破。相關研究文獻對3 種基因編輯技術作了比較（表1）[8]。Ishino 等[9]于1987 年首先發現了大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近存在串聯間隔重復序列。2002年完成了嗜熱鏈球菌全基因組序列測序后，Horvath等[10]首次提出了CRISPR 的概念。Barrangou 等[11]于2007 年證明了細菌用CRISPR 抵御外來噬菌體的入侵，并在自身基因組中留下外來基因片段作為“記憶模式”，其實是廣泛存在于細菌和古細菌中的免疫防御系統。研究表明[12-13]，天然的CRISPR/Cas9 分為Cas9、crRNA 和tracrRNA 3 個部分，crRNA和tracrRNA 通過局部堿基配對組成gRNA，而gRNA 與Cas9 結合后引導Cas9 蛋白識別和切割目標DNA 序列，后來科學家對這一編輯技術進行了改造，將crRNA 和tracrRNA 融合成1 條RNA，并稱其為sgRNA。改造后的CRISPR/Cas9 成為研究者首選的基因編輯研究方法，CRISPR/Cas9 基因編輯技術成為近些年玉米分子育種研究的熱點領域。

表1 基因編輯技術比較

1.2 CRISPR/Cas9 基因編輯類型目前大約有40%細菌和90%古細菌已經被測序，CRISPR/Cas類型有3 種，其中的TypeⅡ型CRISPR/Cas 較為簡單，以Cas9 蛋白以及導向RNA 為核心組成，是在細胞或生物體內引入Cas9 酶和設計不同的導向RNA（sgRNA），來指導Cas9 完成對DNA 的定點切割修飾[14-15]。Type Ⅰ型是相對較為復雜的編輯系統，包含6 個Cas 蛋白質（Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7），主要來源于大腸桿菌等細菌、銅綠假單胞菌等古生菌，其中特征性的Cas3 蛋白具有解旋酶和核酸酶功能，是干擾階段的主要作用酶類。TypeII 型包含4 個Cas 蛋白質（Cas1、Cas2、Cas4、Cas9），主要來源于激烈火球菌等古生菌，Cas9 是分子質量很大的多功能蛋白，能夠參與crRNA 的成熟以及降解入侵的噬菌體核酸或是外源質粒，同時還在剪切crRNA 的成熟和靶標DNA 中起到了重要作用，是目前基因組定向編輯技術的主要應用類型。TypeIII 型包含4 個Cas 蛋白質（Cas1、Cas2、Cas6、Cas10），其中特征性的Cas10 蛋白質主要參與crRNA 的成熟和剪切入侵外源DNA，目前發現存在2 種亞型TypeⅢA 和TypeⅢB。自然界中的CRISPR/Cas 編輯系統具有一定的多態性，因此，立足現有的編輯系統進一步開發新型和高效的基因編輯技術也是關鍵的研究方向。

1.3 CRISPR/Cas9 基因編輯作用原理CRISPR/Cas9 基因編輯的作用原理分為3 個階段。首先是來源于病毒的小段DNA 整合到細菌的CRISPR 中生成新的間隔和重復序列單元，外源DNA 的間隔序列前體側翼有一段保守短序列稱為PAM，它是獲取DNA片段所需的識別序列。其次是CRISPR 在前導序列的驅動下轉錄出前體pre-crRNA，被特定核酸內切酶加工成crRNA，隨后與反式激活tracrRNA 結合形成sgRNA 復合體，引導核酸內切酶移動至病毒DNA 的部位，指引特定的Cas9 酶降解外源核酸[16]。

所以，應用CRISPR/Cas9 基因編輯技術定向改良作物靶基因的流程一般分為6 個步驟：一是靶位點設計；二是構建CRISPR/Cas9 sgRNA 表達載體；三是驗證sgRNA 靶向力；四是作物遺傳轉化和篩選抗性愈傷；五是分子檢測和測序鑒定突變類型；六是再生植株鑒定和后代純合體的篩選。由于CRISPR/Cas9 編輯技術的載體構建較為簡單，具有成本低等優勢，在玉米功能基因驗證、產量、品質和抗性改良分子育種研究中發揮了重要作用。

2 玉米分子育種中的應用概述

2.1 功能基因驗證功能基因驗證、挖掘有效基因為后續開展基因編輯技術或者轉基因等分子育種提供了前提基礎。楊敏等[17]以玉米B104 中克隆的ZmFKF1為靶基因，用CRISPR/Cas9 基因編輯技術進行定點編輯，并對純合突變體進行了表型分析和基因表達驗證，明確了ZmFKF1在玉米開花過程中具有正調控的作用，為玉米分子育種及遺傳改良提供了理論依據。雷海英等[18]以玉米自交系材料B104 為研究受體材料，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術鑒定了玉米發育相關基因ZmCen，推測其與玉米植株雄花序發育有關。邢瑞霞[19]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功獲得了參與玉米光周期調控途徑的敏感基因ZmCCT10和ZmCCT9的相關突變體，驗證了改良玉米開花期，能夠適當縮短生育周期。因此，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術驗證克隆基因的功能，進一步明晰功能基因與性狀的關聯研究具有重要的應用價值。

2.2 產量育種玉米產量提升一直是育種家的研究目標。玉米的種植產量不僅與品種的穗長、穗粗、穗行數、行粒數、粒長和粒重等數量性狀相關，還與玉米種植密度和種植栽培條件有關。玉米雌花花序發育一般開始于9～10 葉期，葉腋分生組織（AM）將轉換成花序分生組織（IM），隨后IM 上形成多行排列整齊的小穗分生組織（SPM），因此，通過提升玉米花序分生組織活性，可以有效增加玉米果穗穗行數和粒重。Liu 等[20]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術突變ZmCLE7和ZmFCP1等位基因資源，精細調控候選基因表達水平，強化了玉米產量性狀，提高了玉米籽粒產量。徐倩等[21]用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對玉米籽粒發育關鍵基因ZmRLK7的2 個靶位點目標DNA 區段序列進行了突變，編輯效率均為25%，為獲得穩定的變異育種材料奠定了基礎。劉超等[22]從玉米自交系B73 基因組數據庫中篩選了3 個穗發育相關的玉米細胞分裂素氧化酶基因CKX4、CKX5和CKX10作為靶標基因，構建了CRISPR/Cas9 玉米基因組編輯載體，為后續的玉米分子育種做了基礎工作。穆路遙[23]所在研究團隊在原有鑒定的3 個調控玉米百粒重的關鍵候選基因Zm079、Zm080、Zm081基礎上，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得了與粒重相關的4 份編輯材料，影響穗長的3 份材料，影響株型的5 份材料，為玉米產量相關基因的探究奠定了堅實基礎。因此，玉米產量相關性狀的基因編輯技術研究是核心的玉米分子育種目標。

2.3 品質育種在玉米品質改良方面的分子育種也是實現高質量玉米品質供給的基礎和應用研究方向。張翔等[24]以玉米自交系京724 為受體材料，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，對玉米2 個香味同源基因ZmBADH2-1和ZmBADH2-2進行了突變，突變體材料中的香味物質（2-AP）含量顯著提高，研究獲得了香型玉米種質材料。祁顯濤等[25]通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術對受體玉米材料的甜糯顯性基因Sh2和Wx1定點突變形成糯性隱性基因sh2和wx1，可以快速高效地創制甜糯玉米性狀的種質材料。魏曉禹[26]以H99 玉米愈傷組織為受體材料，通過對轉化植株的分子檢測、農藝性狀調查和后代種子的品質性狀檢測，表明了ZmPCK2基因能夠控制玉米淀粉和蛋白質含量，改良受體玉米材料的品質。因此，在產量研究的基礎上能夠實現CRISPR/Cas9 基因編輯改良玉米育種材料的品質，對實現更加優質的玉米品種供給非常有價值。

2.4 抗逆育種玉米在整個生長過程中受到不同程度的生物和非生物脅迫，CRISPR/Cas9 基因編輯技術在增強玉米抗旱、抗倒伏、抗除草劑和抗病等方面也有相關的研究成果報道。Shi 等[27]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術將克隆的玉米GOS2啟動子插入ARGOS8基因的5＇-UTR 或者替換ARGOS8基因的啟動子，得到了2 個過表達突變體材料ARGOS8-V1和ARGOS8-V2，與對照相比具有一定的抗旱性；Zhang 等[28]用過表達和CRISPR/Cas9 基因編輯技術證實了stiff1基因影響玉米的莖稈強度，使得玉米莖稈細胞壁中的纖維素和木質素含量發生變化，尤其是CRISPR/Cas9 實現基因敲除后玉米莖稈強度增強，具有顯著的抗倒伏性；Li 等[29]用CRISPR/Cas9 基因編輯技術實現了編碼乙酰乳酸合成酶基因ZmALS1和ZmALS2的編輯，改良了受體玉米材料的抗除草劑性狀，用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對ZmLOX3基因進行敲除后得到突變體材料對玉米黑粉菌的抗性顯著增強。

因此，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術進行功能基因驗證、產量育種、品質育種和抗逆育種等方面的基礎和應用研究，可以不斷明晰玉米相關基因的關聯性狀，有效提升玉米材料的抗性，提升玉米產量和品質，為選育適應種植生長環境的優良玉米品種提供分子育種技術支撐，同時還要在研究過程中考慮到以玉米為代表的作物基因編輯監管問題。

3 基因編輯作物監管

3.1 國際基因編輯監管類型隨著基因編輯作物商業化進程的不斷加快，部分國家對其監管的重視程度也顯著提高，基因編輯作物的研發和應用需要有政府的監管措施。目前，文獻報道了國際上存在的3 種監管模式，都有相應的法律和條例依據[30]。一是以美國和阿根廷為代表的寬松監管，其與轉基因作物的監管不同，僅限于產品的監管，但是做到了信息公開，監管透明；二是以歐盟為代表的謹慎型監管，認為與轉基因作物監管實質等同，要嚴格做到研發和應用全過程監管；三是以澳大利亞為代表的折中型監管，在不同研發階段進行分類監管。研究國外的監管措施能夠對我國的基因編輯監管政策起到借鑒的作用。

3.2 我國基因編輯監管政策基因編輯產品監管與基因編輯產品走向市場應用具有很大的相關性。隨著我國基因編輯技術的研發和應用不斷取得新的成果，我國基因編輯領域的科學家及團隊不斷建議，盡快建立包括玉米在內的作物基因編輯監管政策。因此，農業農村部提出了尊重科學、嚴格監管，有序推進生物育種產業化應用的具體要求。2022 年1月農業農村部發布了新修改的《農業轉基因生物安全評價管理辦法》等規章的決定，還制定公布了《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，主要針對沒有引入外源基因的基因編輯植物，依據可能產生的風險申請安全評價過程。2023 年4 月農業農村部發布了《農業用基因編輯植物評審細則（試行）》，主要從分子特征、環境安全、食用安全和評審程序4 個方面細化了基因編輯植物安全評價內容，進一步明確了《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》的可操作性。4 月28 日農業農村部發布《2023 年農業基因編輯生物安全證書批準清單》，全國首個基因編輯安全證書獲批。這對規范我國農業基因編輯的安全評價管理，促進我國作物育種技術研發與產業發展具有里程碑的意義。

3.3 監管對策建議包括基因編輯玉米在內的作物基因編輯研究都要有科學的研判，確保在安全可控的前提下，加速基因編輯作物研發和應用。一是要加強對國際基因編輯監管經驗的吸收和借鑒；二是要進一步完善我國基因編輯作物的安全評價體系，做到全過程信息化管理并可溯源；三是要繼續推進我國基因編輯的基礎研究和應用研究，實現關鍵領域對“卡脖子”的突破，實現國際領先水平，提升國際競爭力；四是要加大基因編輯技術的專利保護力度，不斷提升科學研究成果轉化效率；五是要加強生物技術的科學知識普及宣傳，積極營造科學認識CRISPR/Cas9 等基因編輯技術的良好社會氛圍。

綜上所述，CRISPR/Cas9 基因編輯技術在玉米分子育種研究過程中取得了廣泛應用，獲得了一批玉米育種材料，有效拓寬了玉米育種種質資源。隨著基因編輯技術的發展，玉米功能基因的進一步挖掘和定點突變驗證，基因編輯技術將會進一步提升我國玉米分子育種成效。同時，要與其他分子育種技術相結合，與常規玉米育種技術相結合，為培育優良的玉米新品種奠定基礎。還要加強科研院所和企業的研發合作和成果轉化，為我國玉米種業的現代化發展提供更加堅實的技術和人才支撐，不斷助力我國農業現代化。