不同濃度褪黑素處理對采后獼猴桃抗灰霉病的影響

段春楊，田登娟，黃二賓，王芳，2，鄧佳，3

(1. 西南林業(yè)大學林學院，云南昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南昆明 650224；3. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南昆明 650224)

獼猴桃是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)多年生草本植物，素有“水果之王”的美譽[1]。 獼猴桃具有重要的經(jīng)濟價值，但由于多種因素易發(fā)生腐爛、病害等，從而失去食用價值[2]，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成損失。 據(jù)報道，常見獼猴桃病害以真菌類病原菌為主，而其中又以青霉病、灰霉病和軟腐病最為普遍[3-6]。 因此，加強獼猴桃采后保鮮相關研究具有十分重要的研究價值、經(jīng)濟價值和社會價值。 采后果實病害的控制方法分為物理、化學、生物方法，目前以化學方法為主。 但隨著生活水平的提高，人們對于健康和環(huán)保問題越來越重視，迫使人們探究更加安全、健康、有效的化學防治替代品。 與化學方法相比，生物方法強調抑菌物質為自然界存在的、可天然提取、非人工合成的天然有機物質，因其具有更高的生物安全性、環(huán)境友好性而成為研究的熱點方向[7]。 褪黑素、鈣、碳酸氫鈉、抗壞血酸、水楊酸、植酸、殼聚糖、海藻糖等能夠抑制水果上病原菌的生長，從而達到降低水果病害發(fā)生率的目的，具有很好的應用前景。 所以，尋找化學殺菌劑的替代物來防治果蔬病害，是今后果蔬產(chǎn)品貯藏保鮮工作的重點之一[8，9]。

褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚類小分子物質，于1995 年首次在植物中被鑒定出來，此后發(fā)現(xiàn)褪黑素存在于多種植物和植物產(chǎn)品中[10-12]。褪黑素在調控植物發(fā)芽、分化、開花、晝夜節(jié)律、光合作用以及成熟和衰老中具有重要作用。 近年來，褪黑素在控制采后病害中的作用已受到廣泛關注。 研究表明，外源施用0.1 mmol/L 褪黑素能抑制櫻桃和番茄果實因感染灰葡萄孢菌引起的灰霉病，并增加相關防御酶和代謝產(chǎn)物水平，提高內(nèi)源性褪黑素和水楊酸含量，從而提高果實抗病性[13]。 此外，褪黑素在蘋果、梨、大棗等種植中得到大量應用，能夠提高果實的貯藏品質。 然而有關褪黑素對采后獼猴桃果實灰霉病生物防治的研究卻少有報道。 因此，本試驗以獼猴桃為材料，研究不同濃度褪黑素對獼猴桃灰霉病的防控效果，篩選出最佳濃度；在此基礎上從生理生化方面研究褪黑素對灰霉菌細胞膜的破壞效果，既為獼猴桃果實灰霉病的生物防治積累資源，也為褪黑素的應用拓展途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種為四川浦江紅心獼猴桃，購于昆明市金馬正昌水果批發(fā)市場。

褪黑素購于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

灰霉菌(Botrytis cinerea)分離自獼猴桃病果表面，置于PDA 培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 褪黑素體外抑菌試驗 (1)對病原菌菌絲的抑制作用:采用十字交叉法，在PDA 培養(yǎng)基中心接種6 mm 灰霉菌菌餅，在其四周距離3 cm 左右處放置4 片濾紙，濾紙分別滴入20 μL 同一處理濃度的褪黑素，褪黑素濃度設為0.05、0.10、0.20 mmol/L，接種好的培養(yǎng)基密封，放入恒溫箱(25℃)培養(yǎng)2 d 后觀察抑菌效果，記錄灰霉菌病斑直徑。 用無菌水取代褪黑素作為空白對照[14，15]，每處理重復3 次。

(2)孢子萌發(fā)率及芽孢管長測定:參考Qin等[16]的方法略改動。 取不同濃度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素和無菌水各1 mL，加至裝有50 mL PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶(容積為100 mL)中，之后加入1 mL 灰霉菌孢子懸浮液(106cfu/mL，下同)，28℃、120 r/min 培養(yǎng)12 h。 每個處理重復3 次。 孢子萌發(fā)率、芽孢管長測定方法參見孔珊珊等[8]的方法。

1.2.2 褪黑素體內(nèi)抑菌試驗 將獼猴桃果實用濃度為2%的次氯酸鈉浸泡2 min 后，用蒸餾水沖洗干凈，置于室溫條件下通風晾干。 將消毒好的獼猴桃果實放在無菌操作臺內(nèi)，用已滅菌的打孔器在果實赤道部位等距離的刺2 個孔(深4 mm、直徑4 mm)，待孔內(nèi)汁液自然晾干后，用移液槍分別向每個孔洞中注入10 μL 灰霉菌孢子懸浮液和10 μL 不同濃度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素，待液體全部吸收后，用自封袋進行單果包裝，置于塑料筐內(nèi)室溫貯藏。 用無菌水取代褪黑素作為空白對照，每個處理5 個果實。

發(fā)病率(%)＝果實發(fā)病總孔數(shù)/果實接種總孔數(shù)×100 。

1.2.3 褪黑素對灰霉菌的溶菌作用 相對電導率的測定參考Elsherbiny 等[17]的方法并做適當調整。 將6 mm 灰霉菌絲塊轉移至含有10 mL PDB培養(yǎng)基的20 mL 離心管中，25℃搖床上120 r/min培養(yǎng)72 h，無菌水清洗菌絲(清除PDB 培養(yǎng)基)并將其轉移至含有4 mL 不同濃度褪黑素的10 mL離心管中，以無菌水處理作為對照，每個處理重復3 次，28℃搖床上120 r/min 培養(yǎng)，分別于4、8、12、24、48、72 h 取樣，并測定電導率R1，后于沸水中加熱30 min，冷卻到室溫后測定電導率R2，計算相對電導率(R1/R2×100%)。

將收集的6 個時間點的樣品在4℃、5000 × g離心2 min。 獲得的上清液用于胞外核酸滲透量和可溶性蛋白含量的測定，樣品的組織部分用于測定丙二醛(MDA)含量。 胞外核酸滲透量以OD260值表示(用Thermo Scientific 賽默飛Nano-Drop 2000 紅外分光光度計測量)，可溶性蛋白和MDA 含量的測定與計算方法參照蘇州研犀生物科技有限公司相應試劑盒的說明書完成。

1.2.4 褪黑素對獼猴桃果實采后貯藏品質的影響 用清水沖洗果皮表面晾干，再用75%乙醇擦試果皮表面自然晾干，待用。 將60 個獼猴桃果實平均分為2 組。 第一處理用最佳濃度的褪黑素浸泡，第二處理用無菌水浸泡，浸泡時間3 min。 所有果實自然晾干進行單果包裝，置于塑料盒內(nèi)室溫貯藏。

分別于處理后第0、2、4、6、8、10 天取果實赤道部位皮下3 ～8 mm 果肉組織，快速置于-80℃冰箱內(nèi)保存。 參見曹建康等[18]的方法測定可溶性固型物(SSC)、可滴定酸(TA)、抗壞血酸(ASA)、還原糖含量。 每次測量5 個果實。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 軟件制圖，采用SPSS Statistics 23.0 軟件進行Duncan’s 多重差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對灰霉菌菌落生長的影響

從圖1 可以看出，培養(yǎng)3 ～5 d，0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理的灰霉菌菌落直徑均與CK存在顯著差異；培養(yǎng)4 d 和5 d，0.10 mmol/L 褪黑素處理的灰霉菌菌落直徑顯著低于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素處理。 所以，褪黑素處理對灰霉菌的生長有顯著抑制作用，0.10 mmol/L褪黑素處理對灰霉的抑制效果優(yōu)于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素處理。

圖1 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌病斑直徑

2.2 不同濃度褪黑素處理對灰霉菌孢子萌發(fā)的影響

從表1 可以得出，與CK 相比，不同濃度褪黑素處理顯著抑制了灰霉菌的孢子萌發(fā)，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理的孢子萌發(fā)率分別比CK 降低29.33、41.66、61.66 個百分點，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理孢子萌發(fā)率顯著低于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素處理。 不同濃度褪黑素處理顯著抑制了灰霉菌的芽孢管長，0.20 mmol/L 褪黑素處理抑制效果優(yōu)于其它兩個濃度。 所以，褪黑素處理對灰霉菌孢子萌發(fā)、孢子管生長均有顯著抑制作用，在所取的褪黑素濃度處理范圍內(nèi)，抑制效果與褪黑素濃度處理呈正相關關系，0.20 mmol/L 褪黑素處理效果最佳。

表1 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌孢子萌發(fā)情況

2.3 不同濃度褪黑素處理對貯藏期獼猴桃果實灰霉病發(fā)病率的影響

由表2 可知，與CK 相比，不同濃度褪黑素處理降低了貯藏期獼猴桃果實灰霉菌的發(fā)病率，至第10 天CK 的獼猴桃果實完全發(fā)病，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理分別比CK 降低40、60、20個百分點。褪黑素處理能夠降低貯藏期獼猴桃果實灰霉病的發(fā)病率，且以0.10 mmol/L 褪黑素處理效果最優(yōu)。

表2 不同濃度褪黑素處理下貯藏期獼猴桃果實灰霉病發(fā)病率(%)

2.4 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌細胞膜通透性的變化

通過檢測灰霉菌菌絲的相對電導率來評估灰霉菌的細胞膜通透性。 從圖2A 可以看出，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲相對電導率隨培養(yǎng)時間的延長總體呈上升趨勢。 培養(yǎng)4 h，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲相對電導率存在顯著差異，且0.20 mmol/L 褪黑素處理顯著高于其它兩個處理；培養(yǎng)8～72 h，不同濃度褪黑素處理和CK的菌絲相對電導率存在顯著差異，但不同濃度褪黑素處理間基本不存在顯著差異。 因此，不同濃度褪黑素處理可顯著提高灰霉菌菌絲的相對電導率。

圖2 不同濃度褪黑素處理對灰霉菌細胞膜通透性的影響

病原菌菌絲體核酸滲透量被認為是細胞膜損傷的一項重要指標。 從圖2B 可以看出，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理和CK 的OD260值在48 h 內(nèi)均呈上升趨勢，并于培養(yǎng)48 h 達到最大值(1.4117、1.5187、2.4713 和1.1793)，之后下降。與CK 相比，褪黑素處理下的細胞外核酸含量顯著升高，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理顯著高于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素處理。 所以，褪黑素處理對灰霉菌細胞膜有顯著破壞作用，在所選褪黑素濃度處理范圍內(nèi)，破壞效果與褪黑素濃度呈正相關，0.20 mmol/L 褪黑素處理效果最佳。

蛋白質泄漏量被認為是細胞膜損傷的另一項重要指標。 從圖2C 可以看出，在整個培養(yǎng)時間內(nèi)，不同濃度褪黑素處理和CK 的可溶性蛋白含量總體呈下降趨勢。 與CK 相比，不同濃度褪黑素處理后的細胞外可溶性蛋白含量升高。 0.20 mmol/L 褪黑素處理的細胞外可溶性蛋白含量在4 h 時達到最大值(2.02 ± 0.0079 mg/mL)。 因此，不同濃度褪黑素處理可顯著提高細胞外可溶性蛋白含量，且0.20 mmol/L 褪黑素處理效果更優(yōu)。

通過測定細胞氧化損傷標志物丙二醛(MDA)的含量可檢測病原菌絲體的脂質過氧化程度。 從圖2D 可以看出，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲體MDA 含量總體呈先上升后下降趨勢。 與CK 相比，培養(yǎng)4、12、24 h 不同濃度褪黑素處理的菌絲體MDA 含量顯著升高。 褪黑素處理的菌絲體MDA 含量在12 h 時達到最大值，之后開始下降并趨于穩(wěn)定。

以上結果表明，褪黑素處理導致灰霉菌細胞膜損傷，細胞膜通透性增加。

2.5 褪黑素處理對貯藏期獼猴桃果實營養(yǎng)品質的影響

從圖3A 可以看出，除了第10 天，0.10 mmol/L褪黑素處理的獼猴桃果實可溶性固形物(SSC)含量均與CK 無顯著差異；與CK 相比，0.10 mmol/L褪黑素處理的抗壞血酸(ASA)含量除了在2 d 和10 d 有顯著差異外，其余時間段無明顯差異(圖3B)；可滴定酸(TA)含量在4 d 和8 d 存在顯著差異，其余時間段無顯著差異(圖3C)；還原糖含量在6 d 和8 d 出現(xiàn)顯著差異(圖3D)。 綜合分析，0.10 mmol/L 褪黑素處理對獼猴桃果實營養(yǎng)品質無不良影響。

圖3 褪黑素處理下貯藏期獼猴桃果實品質相關指標的變化

3 討論與結論

獼猴桃具有重要的經(jīng)濟價值，采后獼猴桃由于運輸中的機械損傷、病菌侵襲、生理性疾病等因素易發(fā)生腐爛、病害等情況，使其失去食用價值。已有研究證明，采后褪黑素處理可以抑制水稻白葉枯病的生長[19]，唐琦[20]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對青霉病的生長有抑制作用，集中表現(xiàn)在對病菌菌落直徑和孢子萌發(fā)兩個方面。 本研究結果表明，0.10 mmol/L 褪黑素處理下的灰霉菌病斑直徑最小，所以，褪黑素處理對灰霉菌的生長菌落有顯著抑制作用；同時，褪黑素處理可明顯抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)、芽孢管長，從而影響灰霉菌菌絲生長，說明褪黑素處理能夠在體外控制灰霉菌生長和分生孢子萌發(fā)，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理抑制孢子萌發(fā)的效果最佳；褪黑素處理能夠顯著降低貯藏期獼猴桃果實灰霉病的發(fā)病率，曹晶晶等[21]的研究中也得到類似結果。

生物激發(fā)子通過破壞細胞膜的通透性和結構或使關鍵細胞成分泄漏，如核酸或蛋白質，從而直接或間接地作用于真菌細胞膜[22]。 相對電導率、丙二醛含量、核酸和可溶性蛋白滲透量可用于評估細胞膜損傷程度[23]。 本研究表明，褪黑素處理增加了灰霉菌的相對電導率和MDA 含量，破壞了細胞膜的結構，使得細胞膜通透性發(fā)生改變，從而導致可溶性蛋白和核酸從細胞膜中釋放出來，其中0.10～0.20 mmol/L 褪黑素處理效果較為明顯。 有學者發(fā)現(xiàn)Bacillus pumilusHR10 破壞了病原菌細胞膜的完整性，影響了其生理細胞成分的產(chǎn)生[24]。 Wang 等[22]發(fā)現(xiàn)，在細胞膜被抗菌物質破壞的情況下，細胞膜的通透性會產(chǎn)生變化，隨后釋放細胞內(nèi)的大分子蛋白。

獼猴桃果實在采摘后仍會進行一系列代謝過程，如能量代謝、呼吸消耗等，果實中的可溶性固形物、抗壞血酸、可滴定酸和還原糖含量的變化可用來評價果實營養(yǎng)品質的好壞[25-29]。 余巧銀等[30]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗酵母(P.membranaefaciens)能在降低西蘭花發(fā)病率的同時，較好地維持果實營養(yǎng)品質，且無不良影響。 趙魯寧等[31]的研究結果表明，季也蒙畢赤酵母Y35-1 菌株不同制劑能夠有效降低采后枇杷炭疽病的發(fā)病率，并且對采后枇杷的果實營養(yǎng)品質也起到一定的維持作用。本研究表明，0.10 mmol/L 褪黑素處理能有效維持貯藏期間獼猴桃果實中的TA、ASA、SSC 和還原糖的含量。 因此，0.10 mmol/L 褪黑素處理采后獼猴桃果實不會對其營養(yǎng)品質產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，褪黑素處理可有效抑制灰霉菌病斑直徑的增長，抑制灰霉孢子的萌發(fā)和芽孢管長度的增長，顯著降低貯藏期獼猴桃果實灰霉病的發(fā)病率，增加灰霉菌細胞膜的通透性，維持貯藏期間獼猴桃果實品質。 綜合分析，0.10 ～0.20 mmol/L的褪黑素處理對獼猴桃采后灰霉病有顯著的抑制效果。 考慮到褪黑素的成本以及過高的褪黑素濃度可能存在一定負面影響等多種因素，在實際生產(chǎn)應用當中，推薦0.10 mmol/L 為最佳褪黑素使用濃度。