恩替卡韋聯合聚乙二醇干擾素抗病毒治療對慢性乙型肝炎患者HBV-RNA水平的影響

馬超，曾明輝，黃玉賢，張鈺斌，邱少霞，范紅順

粵北第二人民醫院感染科，廣東韶關 512028

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。目前，我國約有7 000萬例HBsAg攜帶者，其中CHB患者為2 000~3 000萬例[1-2]。CHB患者肝組織內ccc-DNA的持續存在是CHB難以治愈且停藥后易復發的主要原因[3]。1984年，Miller等首次觀察到與DNA雜合的HBV-RNA；1996年，德國學者K?ck證實了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺苷酰（polyA）化的HBV-RNA。2016年，證實血液中HBV-RNA的主要來源為未經逆轉錄的HBV pgRNA。HBV-RNA作為新的病毒學指標近年得到更多關注，2019年以來我國、歐洲及美國肝病學會均推薦其作為cccDNA存在和轉錄活性的指標[4-6]。肝組織ccc-DNA的檢測需要肝活體組織檢查，因為是有創檢查，推廣受限，而血清HBV-RNA水平可反映肝組織內ccc-DNA的活性，并與患者病毒學應答和預后有關[7-8]。

目前，PEG-IFN-α治療下血清HBV-RNA可否準確反映cccDNA的水平及其轉錄活性，仍需進一步明確。基于此，本研究以2021年1月—2022年6月粵北第二人民醫院收治的恩替卡韋口服1年以上HBV-RNA陰性的39例慢乙肝患者為研究對象，加用聚乙二醇干擾素α-2b聯合原有的恩替卡韋治療24周后，測定CHB患者的血清HBV-RNA水平，分析其與各臨床指標的相關性，旨在為將HBVRNA作為CHB治療評估的新型病毒學指標提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入本院收治的39例慢性乙型肝炎患者，平均年齡（49.1±10.7）歲；男29例，女10例；HBeAg陽性3例，HBeAg陰性36例。本研究得到醫院醫學倫理委員會的批準，患者均在充分了解研究計劃后簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合2019年版慢性乙型肝炎相關診斷標準；②患者已連續服用恩替卡韋（國藥準字20100129）0.5 mg ，1次/d 1年以上，間隔3個月以上兩次經羅氏Cobas試劑檢測，均證實高敏HBV-DNA<20 IU/mL；③知情同意加用聚乙二醇干擾素α-2b 180 μg或135 μg，皮下注射，1次/周，聯合原有的恩替卡韋口服，抗病毒治療24周。

排除標準：①重疊甲型肝炎病毒（hepatitis A vi?rus，HAV)、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）等其他嗜肝病毒感染；②合并有人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染；③合并有藥物性肝病、自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎等其他肝損害病因；④肝惡性腫瘤。

1.3 方法

依據HBV-RNA陰性或陽性分組。所有患者均進行血常規、肝功能、HBV血清標志物、HBV-RNA、肝臟彩超等檢測。高敏HBV-RNA檢測采用羅氏診斷COBAS試劑，檢測下限20 IU/mL。乙肝五項血清標志物（hepatitis B virus serum markers，HBV-M），采用乙型肝炎診斷試劑盒，以化學發光法進行檢測，其中乙肝表面抗原定量（quantification of hepatitis B sur?face antigen，qHBsAg），參考值范圍為0~0.05 IU/mL，有效檢測范圍0.05~250.00 U/mL，乙肝病毒e抗原（hepa?titis B e antigen，HBeAg）參考值范圍為0~0.1 IU/mL。肝功能指標的檢測，采用貝克曼680全自動生化分析儀。以血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine amino?transferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）作為觀察指標。

HBV-RNA檢測采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT）配套儀器為AutoSAT全自動核酸檢測分析系統，原理為HBV特異性RNA寡核苷酸磁珠微粒提取靶標RNA，MMLV酶逆轉錄靶標RNA為cDNA，T7 RNA聚合酶轉錄cDNA，合成大量可檢測的RNA負鏈，用含熒光和淬滅基團的RNA分子信標進行檢測。檢測過程無需DNA酶處理、并采用內標定量，樣本的提取、洗滌、擴增、檢測及定量結果均由配套儀器完成。通過HBV-RNA陰性、弱陽性、強陽性人血清稀釋樣本建立檢測線性范圍和標準曲線，得到每個樣本HBV-RNA的濃度。檢測下限50 copies/mL，線性范圍2~8 log copies/mL。

1.4 統計方法

采用SPSSAU在線統計學軟件進行數據處理。將HBsAg定量及HBV-RNA檢測結果進行對數轉換。符合正態分布的計量資料以（）表示，比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分數（%）表示，比較采用χ2檢驗。HBV-RNA與HBeAg及qHBsAg水平之間的相關性采用Pearson相關系數（r）分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較

據患者血清HBV-RNA是否可檢出分為兩組，RNA陰性患者18例為A組，占比46.2%，其中HBeAg陰性18例，HBeAg陽性0例；男4例，女14例。RNA陽性患者21例為B組，占比53.8%，其中HBeAg陰性18例，HBeAg陽性3例（HBV-RNA均為陽性）；男6例，女15例。兩組臨床資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較()

表1 兩組患者臨床資料比較()

項目ALT（U/L）AST（U/L）PLT（×109/L）年齡（歲）A組（n=18）32.56±14.13 29.11±10.13 170.17±48.91 52.50±12.09 B組（n=21）38.67±35.56 33.57±22.52 163.29±69.28 46.29±8.72 t值-0.724-0.775 0.362 1.859 P值0.476 0.443 0.720 0.071

2.2 兩組HBsAg定量水平比較

A組的HBsAg定量水平低于B組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2、圖1。

圖1 HBsAg在HBV-RNA分組中的分布箱線圖

表2 HBV-RNA陰性和陽性組HBsAg的比較[()，IU/mL]

表2 HBV-RNA陰性和陽性組HBsAg的比較[()，IU/mL]

項目log10（HBsAg）A組（n=18）1.29±1.30 B組（n=21）2.66±0.65 t值-4.053 P值<0.001

2.3 HBV-RNA與臨床特征相關性分析

CHB患者血清HBV-RNA可測與qHBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）呈中等程度正相關。與ALT、AST、PLT、年齡、性別等變量無相關關系，見表3。

表3 HBV-RNA與臨床特征相關性分析

2.4 CHB患者血清HBV-RNA水平的影響因素分析

分別以年齡（賦值：連續性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續性變量）、AST（賦值：連續性變量）、qHBsAg（賦值：對檢測結果進行對數轉換）、HBeAg定量為自變量，以血清HBV-RNA為因變量[賦值：對檢測結果進行對數轉換，即log（HBV-RNA），連續性變量]，進行多因素線性回歸分析。結果顯示，qHBsAg是CHB患者血清HBVRNA水平的影響因素（P<0.05），見表4。

表4 CHB 患者血清HBV-RNA水平的影響因素線性回歸分析結果（n=39）

3 討論

既往研究顯示：核苷酸類似物（NAs）抗病毒治療前，HBV-RNA與HBV-DNA、HBsAg、HBcrAg（乙型肝炎病毒核心抗原相關抗原）均呈正相關，HBeAg陽性患者則更明顯[9-10]。NAs抗病毒治療后與HBV-DNA和HBsAg相關性會逐漸下降甚至消失，但與HBcrAg之間始終保持較好的相關性。接受長效干擾素治療的患者，HBV-RNA與DNA、HB?crAg在治療前后均具有良好的相關性，但治療后與HBsAg的相關性明顯減弱，甚至失去相關性。

那么，同時接受NAs和長效干擾素治療的患者，HBV-RNA的特點及能否用來預測抗病毒治療效果或指導NAs停藥，這方面的資料較少，通常，選擇NAs可強效抑制病毒復制，促進HBV-DNA轉陰，而NAs+peg-IFN聯合治療后，可促進HBsAg下降，治療前HBsAg低水平（<1 500 IU/mL）及治療中HB?sAg快速下降（12周或24周時HBsAg<200 IU/mL或下降>1 lg IU/mL）的患者，聯合治療后HBsAg陰轉的發生率較高[11]。

本研究納入經過NAs抗病毒治療后，HBV DNA已轉陰，且愿意繼續加用長效干擾素的患者為研究對象，入組人群中絕大多數已實現HBeAg血清學轉換。通過測定HBV-RNA水平，并考察HBV-RNA與其他臨床指標的相關性。本研究提示，經過序貫聯合治療后，HBV-RNA與qHBsAg、HBeAg仍具有中等程度相關性（r=0.485、0.387，P<0.05）。本研究發現，經過口服核苷（酸）類似物恩替卡韋治療后，HBV-DNA和HBeAg雙轉陰的患者占比達92.3%（36/39），HBV-DNA和HBeAg雙陰性患者中卻仍有61.1%（22/36）的患者HBV-RNA仍可檢出，且3例HBeAg陽性患者HBV-RNA均為陽性。箱線圖提示HBV-RNA與HBsAg水平密切相關，表面抗原滴度低于10 IU/mL者（HBsAg<1log)，HBV-RNA檢測值均為陰性；而HBV-RNA轉陰的患者，HBsAg整體水平較低，多在2.5log以下（見圖1）。

李小鵬等[12]選取70例高敏HBV-DNA檢測均為陰性的CHB患者，發現58例患者血清HBV-RNA仍為陽性，達到（2.7±1.1）log copies/mL，血清HBVRNA水平與HBeAg 水平呈顯著正相關（r=0.467，P=0.01），但與qHBsAg水平無顯著相關（r=0.146，P=0.275）。本研究發現，qHBsAg及HBeAg均是CHB患者血清HBV-RNA水平的影響因素，CHB患者血清HBV-RNA可測與HBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）中等程度相關，進一步的線性回歸分析僅顯示qHBsAg為影響因素，可能與入組患者中HBeAg陽性例數較少有關，二者相關性尚待進一步更大樣本量的研究證實。

NAs停藥后臨床復發的預測一直是關注的熱點。基于目前國內外指南推薦的停藥標準[1,13-14],聯合HBV-RNA指標可進一步降低停藥后復發風險。然而，研究表明即使血清HBV-RNA轉陰，也仍有部分患者存在復發風險，可見仍未真正達到“安全”停藥之目標。2020年南方醫科大學的研究團隊發現，聯合血清HBV-RNA及其他指標可以進一步降低停藥后臨床復發率[15]。基于既往停藥標準（HBV-DNA和HBeAg轉陰），NAs停藥后4年累積臨床復發率高達30.8%，通過聯合HBV-RNA，NAs停藥后4年累積臨床復發率降至15.3%；而進一步聯合HB?crAg，4年累積臨床復發率則為0%。這項研究提示將HBV-RNA、HBcrAg兩個指標聯合用于預測NAs停藥后的臨床復發大有可為。2021年香港大學袁孟峰教授團隊發表在GUT雜志上的一項研究，發現停藥時HBV-RNA陰性+HBsAg<10 IU/mL的患者，NA停藥后1年累積病毒學復發率為9.1%，顯著低于單獨使用HBV-RNA或HBsAg水平指導停藥的患者（分別為36%~52%和36.7%）[16]。本研究證實，HBsAg低于10 IU/mL的患者，HBV-RNA一般呈陰性，故也可指導沒有條件行HBV-RNA檢測的地區或患者，若有強烈停藥意愿，也可通過對HBsAg定量檢測的充分評估，嘗試停藥。而HBV-RNA陽性組同時也伴有高水平的HBsAg（平均值2.5log），與我國專家共識一致[9]：對于符合現行停藥標準的接受鞏固治療的患者，若血清HBV-RNA檢測陽性，停藥后疾病復發風險較大，不建議停藥。

綜上所述，經過NAs及peg-IFN-α序貫治療后，HBV-DNA陰性的CHB患者血清HBV-RNA水平存在較大差異，HBeAg、qHBsAg與血清HBV-RNA水平具有相關性，且qHBsAg是CHB患者HBV-RNA低于檢測下限的影響因素。研究顯示，低水平HB?sAg（<10 IU/mL）多提示HBV-RNA陰性，CHB患者血清HBV-RNA水平在一定程度上可反映cccDNA轉錄活性，今后有望指導NAs停藥。本研究仍有著局限。沒有聯合干擾素前的HBsAg定量及HBVRNA資料，難以比較其動態變化。樣本量較少，HBeAg陽性的患者較少。之后將在下一步的工作中，通過更完善的研究設計，加以改進，以進一步探索HBV-RNA的預測效能。