骨碎補總黃酮對乳牙牙髓干細胞增殖及成骨向分化的影響

李春梅，高艷宇，李慧

黑龍江省醫院口腔科，黑龍江哈爾濱 150001

乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoli?ated deciduous teeth，SHEDs）是一種外胚層來源的間充質干細胞，除了具有多向分化潛能及低免疫原性外，還表現出極強的增殖能力和成骨分化效率，在骨組織工程領域中備受青睞[1-3]。骨碎補總黃酮（total flavone of rhizoma drynariae，RDTF）是從百合科植物黃精中提取到的一種活性成分，可以從阻礙破骨細胞產生和促進新骨形成兩方面增進骨骼健康[4-5]。關于RDTF對SHEDs的功能調控作用尚未見相關報道。本實驗通過探究不同濃度RDTF對SHEDs增殖和成骨分化潛力的影響，2020年3月—2021年8月黑龍江省醫院檢驗科初步篩選出適宜濃度的RDTF，為實現SHEDs在骨缺損修復的臨床應用提供實驗基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

抗壞血酸（北京索萊寶），RDTF（西安楊凌慈緣）、CCK-8試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒（上海碧云天），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hy?Clone，美國）

1.2 方法

1.2.1 SHEDs的分離與培養 本研究經患者及家屬知情同意，收集口腔科因乳牙滯留而拔除的乳牙樣本，要求牙齒無明顯病變，牙根吸收小于1/2。4 h內在無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，用含2%青-鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered so?lution，PBS）反復沖洗并充分剪碎，待細胞生長至80%融合時，用胰蛋白酶消化后傳代培養。收集對數期生長的3~5代細胞用于后續實驗。

1.2.2 SHEDs的鑒定 SHEDs消化重懸，取細胞懸液以1×106個/管加入待測樣本管中。使用人間充質干細胞( mesenchymal stem cells, MSC)表面標記檢測試劑盒對SHEDs進行鑒定，按照說明書進行操作。

1.2.3 鈣鈷法染色 將SHEDs以1×105個/孔到接種到6孔板上，用成骨誘導培養液為溶劑，配置0、12.5、25、50 mg/L RDTF的培養液。實驗共分為4組，（0時段為對照組，24、48、72 h組）每組設置3個復孔，連續培養7 d后進行檢測。雙蒸水潤洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot 實驗分組及成骨誘導步驟同1.2.3。分別加入骨轉錄因子2(runt-related transcrip?tion factor 2, Runx2)、骨鈣素(osteocalcin, OCN）和β-ac?tin一抗（按1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜，PBS清洗，加二抗（按1∶10 000稀釋），室溫孵育1 h，PBS清洗，用化學發光試劑盒顯色后，將膜置于凝膠成像系統中觀察顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 觀察指標

統計分析堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）。

1.4 統計方法

應用GraphPad Prism 5統計學軟件對數據進行分析，計量資料經檢驗符合正態分布，以（）表示，采用t檢驗；多重比較方差齊性時用各研究組分別與對照組進行兩兩比較，采用Dunnett-t檢驗；方差不齊時采用Dunnett-T3檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SHEDs分離培養情況

成功分離培養SHEDs。鏡下觀察，大部分原代細胞在培養第3天貼壁生長，第7天可見克隆細胞團形成，細胞呈集落狀生長，胞體短小呈梭形，胞核較大呈圓形，第10天后細胞生長達到一定融合度。進行傳代培養后，第一代細胞迅速增殖，密度增大，形態以紡錘形和長梭形為主，呈旋渦狀生長。見圖1。

圖1 SHEDs的培養（×100）

2.2 SHEDs的鑒定結果

SHEDs擴增培養至第3代，流式細胞儀對其表面抗原物質的表達進行鑒定。檢測結果顯示，間充質干細胞標志物CD73、CD90及CD105表達率高于99%，造血干細胞及單核細胞標志物CD34、CD19、CD45、CD11b及HLA-DR總體表達率低于1%（圖2A）。成骨誘導21 d后，茜素紅染色后可見細胞間橙紅色礦化結節（圖2B）。

圖2 SHEDs的鑒定

2.3 RDTF對SHEDs ALP染色及ALP活性的影響

以含有12.5、25、50 mg/L RDTF的為研究組，以不含RDTF的為對照組在細胞成骨誘導培養的第7天，鈣鈷法檢測ALP染色結果顯示：各組在鏡下能觀察到黑棕色的染色結節，與對照組相比，25 mg/L RDTF組形成的染色結節數目最多，面積最大，其次是12.5 mg/L RDTF組（圖3）。

圖3 不同濃度RDTF對SHEDs ALP染色結果

成骨誘導7 d后，ALP 活性定量檢測結果顯示：與對照組相比較，12.5、25 mg/L RDTF 組 ALP 活性均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），其中25 mg/L RDTF 組ALP值的提升更為顯著，見表1。

表1 RDTF對SHED ALP 活性的影響()

表1 RDTF對SHED ALP 活性的影響()

注：與對照組比較，*P<0.05

組別對照組（n=3）12.5 mg/LRDTF 組（n=3）25 mg/L RDTF 組（n=3）50 mg/L RDTF 組（n=3）F值P值7 d ALP 表達量254.896±4.573（308.756±10.369）*（332.313±7.373）*249.660±14.061 52.038<0.001

3 討論

在探討SHEDs成骨分化的研究中，首先要驗證RDTF對SHEDs生長狀況的影響。因此，本研究采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，結果顯示各組光密度（optical density, OD）值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示一定濃度范圍內的RDTF對SHEDs的增殖能力無顯著影響，這與龐真貞等[6]，杜志豪等[7]學者的研究結果，OD值在第6天達到高峰值(OD值=0,43)一致。因此確定設置此干預濃度范圍，進行后續成骨實驗的研究。ALP作為成骨細胞分化早期的標志物之一，有學者報道代表著細胞外基質的成熟程度（ALP=3.324 mmol/L）[8]。它在一定程度上可以反映出細胞的成骨分化能力，其活性升高則代表骨礦化過程處于活躍階段。龐真貞等[6]研究報道Runx2是重要的轉錄因子，在細胞成骨分化的早期階段起到關鍵的調節作用，PCR結果顯示Runx2表達最高為25 mmol/L[9]。Runx2的表達標志著成骨細胞開始分化，目前已被證實可以誘導成骨相關基因OCN的表達。Moghadam FH等[10]報道OCN是成骨細胞向新骨形成過程的特異性指標，當細胞進入成骨分化晚期即礦化期，PCR結果顯示OCN為40 mmol/L其表達到達高峰(2.332 mmol/L)。OCN主要由成骨細胞合成分泌至細胞外基質中，不僅起到結構支撐作用，還在骨鈣代謝過程中起重要調節作用，加速基質礦化。本研究從蛋白水平對SHEDs早期及晚期的成骨分化能力進行檢測，結果顯示，在成骨誘導14 d后，12.5、25 mg/L RDTF組均能上調Runx2及OCN的蛋白表達，其中25 mg/L RDTF組的Runx2及OCN蛋白表達水平（332.313±7.373）呈顯著上調趨勢，這與Huang Y等[11]研究的RDTF對恒牙牙髓干細胞的誘導作用（濃度為50 mg/L表達123·213 mg/mmol）不一致，本研究作用更明顯，這可能是乳牙牙髓干細胞活性更強的原因。ALP 作為成骨細胞分化早期的標志物之一，代表著細胞外基質的成熟程度。骨形成的關鍵在于羥基磷灰石的沉積，其過程不僅有游離磷酸的參與，同時又受到焦磷酸鹽抑制局部礦化能力的影響[12]。本研究在早期對ALP活性進行了定量檢測，結果顯示：12.5和25 mg/L PSP組的ALP的表達均顯著提升(P<0.05)。而較高濃度（50 mg/L）PSP組與對照組相比，其ALP活性未見明顯升高。鈣鈷法染色的ALP定性實驗結果也印證了這一結論，這與Zhai Q等[13]研究報道的對牙周膜干細胞培養的結果相吻合（結果為16.231 mg/mmol）。Runx2是成骨分化中最早必不可少的特異性標志基因，其表達標志著SHEDs開始向成骨細胞分化和成熟[14]。研究結果表明，一定濃度的PSP對SHEDs的成骨分化具有促進作用，這與Peng X等[15]研究的其他中藥作用并不一致（結果為11.4 mg/L），可能是因為藥理作用不同而導致。體內研究還需進一步研究證實。

綜上所述，骨碎補總黃酮對乳牙牙髓干細胞增殖及成骨向分化有增強作用，可為乳牙牙髓干細胞治療骨質疏松提供理論基礎和依據，為臨床應用提供參考。