人接頭蛋白LNK對非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響

王 杰, 谷 婷, 宋吉欣, 吳吟秋, 戴 春, 戴 華

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001; 3. 江蘇省揚中市人民醫院 普外科, 江蘇 揚中, 212200)

肺癌是人類常見的惡性腫瘤, 其是最主要的癌癥死亡原因[1-2], 且肺癌呈現逐年攀升的趨勢,并成為危害人類衛生健康的重大疾病。肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC), 其中NSCLC是肺癌最主要的病理類型,占80%～85%。由于大多數NSCLC患者初次診斷即為晚期局部侵襲或遠處轉移,患者的5年生存率僅為4%～17%[3]。隨著癌癥篩查和治療手段的改進, NSCLC患者的2年生存率有所提高,提示深入研究NSCLC發生發展的分子生物學機制,發掘新的腫瘤早期診斷和藥物干預靶點,采取更具針對性的干預措施來降低肺癌致死率及改善患者預后,具有積極的臨床意義。

淋巴細胞接頭蛋白LNK(SH2B3)由12號染色體上的SH2B3基因編碼,高表達于淋巴細胞,負性調節JAK2-STAT3等信號通路來抑制造血干細胞的自我更新能力[4-5], 敲除LNK會導致造血干細胞增生失控、造血干細胞池的穩態失衡[6-7]。研究[8]發現, LNK過表達與間變性甲狀腺癌的不良預后顯著相關,高級別卵巢癌臨床樣本中也發現LNK存在高表達現象,并促進卵巢癌細胞的增殖和轉移。此外,有研究[9]發現在幾種有LNK基因基礎表達的實體瘤細胞,如前列腺、腦組織細胞中強制過表達LNK基因,細胞增殖水平并無改變。課題組采用生物信息學分析發現LNK在肺癌組織中顯著低表達,提示LNK在實體瘤中的生物學功能較為復雜。目前, LNK與肺癌發生發展之間的關系尚缺乏研究,為進一步明確LNK在實體腫瘤中的作用機制,本研究以NSCLC細胞株為模型,開展人接頭蛋白LNK(hLNK)與肺癌發生的相關性研究,為發掘肺癌新的作用靶點及臨床治療新措施提供理論依據,也為豐富LNK生物學功能提供依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株及質粒

人NSCLC細胞株NCI-H1299(H1299)購自中國科學院細胞庫,慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1A-GFP-T2A-Puro(pCDH)由江蘇大學于峰博士課題組饋贈,重組質粒 pCDH-hLNK由本實驗室構建,過表達hLNK的病毒液由本實驗室制備、保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清(新西蘭VIVACELL)、1640培養基(南京凱基生物)、抗hLNK多克隆抗體(美國R&D公司)、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG(H&L, 中國金斯瑞公司)、HRP標記羊抗兔IgG(H&L, 上海捷瑞生物公司)、Lipo 8000TM轉染試劑(上海碧云天生物)、ECL發光液(合肥Biosharp生物公司)、基質膠(美國Coring公司)。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析hLNK在NSCLC組織中的差異表達: 采用生物信息學技術,運用GEPIA2數據庫中的信息分析hLNK在肺癌組織及其癌旁對照組織中的表達。

1.3.2 過表達hLNK的NSCLC細胞株的構建: 取對數生長期的人NSCLC細胞株H1299, 胰酶消化后計數,鋪24孔板, 3×105個/孔,加入轉染增強劑polybrene及慢病毒液,輕輕混勻, 37 ℃培養箱孵育60 min, 每20 min輕彈管壁2～3次; 第2天,吸取上層培養基,用預熱好的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,更換新鮮完全培養基。轉染3 d后,用工作濃度的嘌呤霉素篩選,陽性細胞命名為H1299-hLNK, 對照細胞命名為H1299-pCDH。

1.3.3 Western blot分析hLNK蛋白的表達水平: 將處于對數生長期的細胞株按1.3.2的方法處理,鋪6孔板, 2×106個/孔,待其貼壁12 h后滴加預冷的PBS, 洗滌3次; 滴加含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白裂解液,冰上靜置10 min, 收集細胞裂解液, 4 ℃, 12 000轉/min離心15 min, 蛋白定量調整至20 mg/mL左右,分裝, 20 ℃保存。將蛋白樣本變性處理后,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 3 h; 5 %脫脂牛奶室溫封閉, 1 h; 抗hLNK的抗體孵育, 4 ℃過夜; 隨后洗膜緩沖液(TBST)洗3次, HRP標記的二抗室溫孵育, 30 min; 同上洗滌后, ECL顯色液顯色,發光儀發光、拍照。

1.3.4 平板克隆實驗分析hLNK對NSCLC細胞增殖能力的影響: 按1.3.2的方法處理過表達hLNK細胞H1299-hLNK及對照H1299-pCDH細胞,接種至含有10 mL完全培養基的培養皿中, 1 000個細胞/皿,每組設3復皿,輕輕搖動使細胞分布均勻,置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱,靜置培養2周。棄培養基, PBS洗滌3次; 0.1%結晶紫染色, 10 min, 緩慢流水沖洗,自然風干,觀察、拍照。

1.3.5 劃痕實驗分析hLNK對NSCLC細胞遷移能力的影響: 同上處理細胞,鋪6孔板,待細胞生長至70 %～80 %融合度,用白槍頭輕劃培養皿得3條平行細線,分別于0、12、24小時在顯微鏡下觀察固定地點劃痕寬度,拍照記錄并用軟件分析差異。

1.3.6 Transwell實驗分析hLNK對NSCLC細胞侵襲能力的影響: 將處于對數生長期的細胞經PBS洗滌,添加無血清培養基,饑餓培養2 h; 隨后胰酶消化、重懸計數,無血清培養基水化底膜30 min; 預冷的matrigel稀釋至30 μg/mL, 滴加至下層小室, 600 μL/室,置4 ℃冰箱30 min, 隨后吸凈下層matrigel, 滴加完全培養基, 600 μL/室; 上層小室滴加matrigel (100 μg/mL), 100 μL/室,待matrigel凝固后滴加細胞懸液至上層小室,繼續培養過夜; 取出Transwell小室, PBS輕柔洗滌2次,并用棉簽小心擦去上層殘留, 4%多聚甲醛固定20 min, PBS洗滌,同1.3.5方法染色,觀察、拍照。

1.3.7 Western blot分析NSCLC細胞中上皮間質轉化(EMT)相關標志蛋白水平: 將對數生長期的NSCLC細胞按1.3.3的方法處理細胞,提取細胞總蛋白,電泳、轉膜、封閉。隨后使用EMT 相關標志蛋白E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的特異性抗體及其相應二抗,依次孵育, ECL發光顯影,檢測過表達hLNK細胞H1299-hLNK及對照H1299-pCDH細胞中上述蛋白的表達。

1.4 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行統計分析,數據組間比較行卡方檢驗,P<0.05為差異有統計學意義,采用GraphPad軟件做圖。

2 結 果

2.1 hLNK在NSCLC組織中的差異表達分析

采用生物信息學方法分析hLNK在NSCLC組織及其正常對照中的差異表達情況,結果表明,肺鱗癌組織、肺腺癌組織中hLNK的表達低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1。

紅色為腫瘤組織,黑色為癌旁組織。與癌旁組織比較, ?P<0.05。圖1 肺腺癌和肺鱗癌(均為NSCLC)中hLNK的表達水平分析

2.2 NSCLC穩轉細胞株的構建

H1299經慢病毒感染后按常規方法裂解細胞, Western blot分析各細胞株中hLNK蛋白的表達水平。結果顯示, H1299-hLNK細胞中hLNK表達水平高于對照細胞1299-pCDH, 差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2。說明過表達hLNK的NSCLC穩轉細胞株H1299-hLNK構建成功,不同濃度的病毒感染后, hLNK的表達具有差異,相較于H1299-hLNK1, 細胞株H1299-hLNK2.5的hLNK表達量更高一些,后期選擇H1299-hLNK2.5(下文簡稱為H1299-hLNK)進行后續實驗。

圖2 Western blot分析各細胞株中hLNK的表達水平

2.3 hLNK蛋白水平的變化對NSCLC細胞系增殖的影響

如1.3.3處理過表達hLNK細胞H1299-hLNK及對照H1299-pCDH細胞, 15 d后分析各培養皿中克隆增殖的情況。結果顯示,過表達hLNK后NSCLC細胞株H1299-hLNK的增殖能力受到抑制(P<0.05), 見圖3, 提示hLNK可能在NSCLC中發揮著抑癌的作用。

圖3 平板克隆實驗分析hLNK過表達對NSCLC細胞株H1299增殖的影響

2.4 hLNK蛋白水平的變化對NSCLC細胞系遷移的影響

將hLNK過表達的細胞株及其對照細胞(H1299-pCDH)處理后,采用劃痕實驗分析hLNK表達水平改變后對NSCLC細胞遷移的影響。結果顯示,hLNK過表達后,H1299-hLNK的遷移能力受到抑制(P<0.05), 見圖4, 提示在NSCLC中hLNK的低表達可能對NSCLC的進展具有促進作用。

A: H1299-pCDH和H1299-hLNK代表性劃痕實驗圖; B: 結果統計圖。與H1299-pCDH比較, ?P<0.05。圖4 劃痕實驗分析hLNK過表達對非小細胞肺癌細胞H1299遷移的影響

2.5 hLNK對NSCLC細胞的上皮間質轉移能力的影響

將上述構建的穩轉細胞株H1299-hLNK及其對照細胞(H1299-pCDH)處理后,進行Western blot分析。結果表明, hLNK過表達后,細胞中上皮細胞標志物E-Cadherin的表達顯著上調(P<0.05), 而間質細胞標志物N-Cadhrein、Vimentin的表達顯著下調,表明hLNK過表達對NSCLC的EMT具有顯著的抑制作用。見圖5。

圖5 Western blot分析hLNK過表達對NSCLC細胞株EMT的影響

3 討 論

在中國,肺癌的發病率和致死率依然高居不下,而腫瘤的異質性和預后差是導致肺癌患者病死率高的重要原因[10]。深入探索NSCLC發生發展的分子機制,優化肺癌亞型的診斷和治療策略依然是臨床所急需關注的問題。

LNK作為接頭蛋白SH2B3家族中的重要一員,已明確其高表達在造血祖細胞及其前體細胞中并發揮負性調控作用,對穩定造血干細胞池具有重要意義[11-13]。LNK是一種重要的篩查因子,既往研究[14]表明,LNK突變會導致多種血液病和血管炎癥,沉默LNK會激活CD34+造血干細胞中的JAK-STAT信號通路,從而顯著促進多系血細胞增殖。淋巴細胞中LNK通過增強STAT4磷酸化,促進γ-干擾素生成,從而抑制人高血壓和高血壓慢性腎損傷的進展[15]。但有研究[8, 13]發現, LNK在實體腫瘤,如黑素瘤、低分化甲狀腺癌中高表達確促進了該類腫瘤的發生發展; 在高級別卵巢癌中, LNK高表達主要通過抑制腫瘤細胞的體積和遷移能力,增強細胞黏附來提高其侵襲能力[9]。上述研究表明, LNK的功能未被完全闡釋清楚。本研究發現,肺癌中LNK處于顯著低表達水平,平板克隆及CCK8實驗均表明,過表達LNK的NSCLC細胞的克隆增殖以及遷移能力被顯著抑制,初步表明在NSCLC中LNK具有抑癌作用, LNK的低表達可能促進了肺癌進展。隨后,通過分析EMT標志性蛋白的差異表達水平,發現過表達LNK的H1299細胞中E-Cadherin顯著增強,而N-Cadherin和Vimentin顯著下調,說明LNK過表達抑制了NSCLC細胞向EMT方向的轉變。上述分析進一步表明, LNK在NSCLC組織中低表達促進了腫瘤的增殖和侵襲,與其不良預后密切相關。

研究[16]表明,高表達環狀RNA(circRNA),如circ-CPA4可促進N-Cadhrein、Vimentin的表達,在NSCLC細胞的進展、耐藥和腫瘤免疫微環境調控具有重要作用; 此外,經典的JAK/STAT3信號通路聯合PD-L1軸同樣在NSCLC的進展及耐藥中發揮著重要作用[17]。研究[18]發現, E-Cadherin負調節蛋白SNAIL通過促進腫瘤源性CXCL2分泌誘導M2巨噬細胞活化浸潤,從而導致患者肺轉移和預后不良。上述均引起作者對以下方面進行思考: 在實體瘤,尤其是NSCLC中, LNK與EMT蛋白之間的結合關系; LNK通過其哪個結構域發揮主要作用,是否還具有EMT之外的通路,如通過JAK-STAT軸,影響NSCLC增殖和遷移。本研究將進一步實驗以探討上述思考點。

綜上所述,本研究以NSCLC為研究對象,發現LNK在其發生發展過程中發揮著抑癌基因的功能, LNK的缺失使得NSCLC細胞大量擴增,遷移加快, EMT進程加快。本研究為進一步分析NSCLC的臨床治療靶標提供了理論支持,也為完善LNK的生物學功能提供理論依據。