大車前苷作用于脂多糖誘導的小鼠膿毒癥心肌損傷實驗研究

周文杰, 呂 剛, 劉華芬

(武漢大學人民醫(yī)院, 1. 心內(nèi)科導管室, 2. 麻醉科, 湖北 武漢, 430060)

膿毒癥是感染導致的宿主免疫反應(yīng)失衡引起的臨床綜合征[1], 在膿毒癥期間,許多重要器官均會受累,其中心血管系統(tǒng)是膿毒癥常見的損傷系統(tǒng)。膿毒癥引起的心肌功能障礙主要表現(xiàn)為左室舒張功能不全和射血分數(shù)降低[2]。存在膿毒癥心肌損傷的患者病病死率較高[3],因此尋找一種減輕膿毒癥期間心肌功能障礙的治療方法十分重要。大車前苷是傳統(tǒng)中藥車前草中的活性成分,大車前苷具有多種生物活性,如抗氧化、抗炎、抗凋亡以及抗腫瘤作用[4-6]。既往研究[7]表明,大車前苷可通過組蛋白脫乙酰基酶2(HDAC2)與蛋白激酶B(AKT)途徑減輕異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚。但關(guān)于大車前苷對于膿毒癥心肌損傷的作用尚未闡明,因此,本研究探討大車前苷在膿毒癥心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

大車前苷(貨號HY-N0031)購于美國MedChemExpress生物科技公司,高效液相色譜法檢測其純度>98%。脂多糖(貨號SMB00610)購于美國Sigma公司,該藥物用于膿毒癥模型的制作; 提取RNA的Trizol試劑(貨號 15596)購于美國Thermo Scientific公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號4896866001)以及SYBRGreen I Master(貨號 4913914001)購自瑞士羅氏公司; ApopTag熒光素原位凋亡檢測試劑盒(貨號 S7110, Millipore)購于Merck公司; 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(貨號 A003-1-1)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(貨號 A020-2-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性檢測試劑盒(貨號 G015-1)均購于南京建成生物工程研究所。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒(貨號SEA478Mu)購于武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。4-羥基壬烯醛(4-HNE)檢測試劑盒(貨號 ab238538)購于美國Abcam公司。小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號BMS607-3TEN)、小鼠巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA檢測試劑盒(貨號BMS6005)購于美國eBioscience公司。

1.2 模型建立與分組

選取8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠40只,體質(zhì)量為23.5～27.5 g, 購自北京華阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)于武漢大學實驗動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,恒溫、恒濕, 12 h晝夜節(jié)律,并可自由飲食。本研究涉及的所有動物實驗均通過武漢大學動物倫理委員會批準。小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表法分為4組,每組10只,分別為生理鹽水+生理鹽水組、生理鹽水+大車前苷組、脂多糖+生理鹽水組、脂多糖+大車前苷組。脂多糖+生理鹽水組與脂多糖+大車前苷組小鼠接受單次腹腔注射脂多糖(10 mg/kg)構(gòu)建小鼠膿毒癥模型,生理鹽水+生理鹽水組與生理鹽水+大車前苷組小鼠接受同等體積生理鹽水腹腔注射。生理鹽水+大車前苷組與脂多糖+大車前苷組小鼠進行連續(xù)5 d的大車前苷50 mg/(kg·d)灌胃干預,生理鹽水+生理鹽水組與脂多糖+生理鹽水組進行同等體積生理鹽水灌胃。實驗第1天,生理鹽水+大車前苷組小鼠給予連續(xù)5 d的大車前苷 50 mg/(kg·d)灌胃干預,生理鹽水+生理鹽水組進行同等體積生理鹽水灌胃。實驗開始第1天,生理鹽水+大車前苷組小鼠連續(xù)5 d灌胃給予大車前苷(50 mg/kg), 生理鹽水+生理鹽水組小鼠給予同等體積生理鹽水灌胃; 灌胃第5天,脂多糖+生理鹽水組小鼠給予脂多糖(10 mg/kg)單次腹腔注射,生理鹽水+生理鹽水組小鼠腹腔注射同體積生理鹽水, 12 h后檢測心功能并取材。

為研究大車前苷對膿毒癥小鼠病死率的影響,另取40只8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠,隨機分成同樣4組,連續(xù)進行大車前苷50 mg/(kg·d)或者等體積生理鹽水灌胃5 d, 灌胃第5天單次腹腔注射10 mg/kg脂多糖或者等體積生理鹽水后,繼續(xù)飼養(yǎng)7 d, 并記錄小鼠死亡情況。

1.3 心功能檢測及取材

小鼠脂多糖腹腔注射12 h后, 2.5%異氟烷吸入麻醉后,胸前區(qū)備皮下進行心臟超聲檢查,利用Vevo 2100小鼠超聲儀評估小鼠心功能情況。心功能指標包括左室射血分數(shù)和左室短軸縮短率。超聲期間,小鼠置于37 ℃的恒溫墊上,超聲期間避免用力壓迫小鼠胸腔,以免影響小鼠正常心率。完成檢測后處死小鼠并收集血液、心臟標本,用于生化和病理檢測。

1.4 組織TUNEL染色

將小鼠心臟組織石蠟切片脫蠟、水合后,按照ApopTag熒光素原位凋亡檢測試劑盒(貨號 S7110, Millipore)說明書進行檢測,最后用DAPI封片后即可在OlympusDX51熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的陽性信號。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

取左心室組織樣本,用TRIzol裂解液研磨裂解后提取總RNA, 再利用Nanodrop 2000測定所提RNA純度并計算含量,然后利用Transcriptor cDNA Synth Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 利用SYBRGreen I Master進行目的基因[過氧化物歧化酶2(SOD-2)、谷胱甘肽氧化酶1(GPX-1)、過氧化氫酶(CAT)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、TNF-α、MCP-1、白細胞介素-4(IL-4)]的表達檢測。GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 相關(guān)指標引物序列

1.6 生化檢測

獲得血液標本靜置30 min后,以12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后,取上清,然后利用cTnI、LDH試劑盒檢測上清中cTnI以及LDH水平。取50 mg新鮮左心室組織利用勻漿液充分勻漿后,以12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后,取上清,利用MDA試劑盒、4-HNE試劑盒、TNF-α檢測試劑盒、MCP-1檢測試劑盒以及Caspase-3活性檢測試劑盒檢測相關(guān)因子的表達或者活性。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心功能和心肌損傷比較

脂多糖+生理鹽水組小鼠的左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率以及心率低于生理鹽水+生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1; 脂多糖腹腔注射后可以導致60%的小鼠死亡,大車前苷治療后(脂多糖+大車前苷組)可提高膿毒癥小鼠存活率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。脂多糖+生理鹽水組小鼠的cTnI和LDH水平高于生理鹽水+生理鹽水組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)小鼠的cTnI、LDH表達水平低于脂多糖+生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2。

A: 小鼠心率; B: 射血分數(shù); C: 左室短軸縮短率; D: 生存率。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖1 各組小鼠心功能比較

A: cTnI水平; B: LDH水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖2 各組小鼠心肌損傷標志物

2.2 各組小鼠心臟氧化應(yīng)激情況比較

脂多糖+生理鹽水組的小鼠MDA、4-HNE水平高于生理鹽水+生理鹽水組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與脂多糖+生理鹽水組小鼠相比,大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低心臟中由脂多糖誘導產(chǎn)生的MDA和4-HNE的水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖3。與生理鹽水+生理鹽水組小鼠相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠心臟中的SOD-2、GPX-1以及CATmRNA水平降低,經(jīng)過大車前苷處理后,脂多糖導致的SOD-2、GPX-1以及CATmRNA的低表達水平得到恢復,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖4。

A: MDA水平; B: 4-HNE水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖3 各組小鼠心臟MDA、4-HNE相對水平

與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖4 各組小鼠心臟中SOD-2、GPX-1以及CAT的mRNA相對水平

2.3 各組小鼠心臟炎癥情況比較

與生理鹽水+生理鹽水組相比,脂多糖可以明顯誘導小鼠心臟中TNF-α和MCP-1的表達上調(diào)(P<0.05), 經(jīng)過大車前苷處理后, TNF-α和MCP-1的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖5)。與生理鹽水+生理鹽水組小鼠相比,脂多糖導致小鼠心臟中IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 與脂多糖+生理鹽水組小鼠相比,大車前苷可以降低脂多糖誘導上調(diào)的IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖6)。

A: TNF-α相對水平; B: MCP-1相對水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖5 各組小鼠心臟中TNF-α以及MCP-1相對水平

2.4 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較

與生理鹽水+生理鹽水組的小鼠相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠心臟中Caspase-3活性上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低脂多糖(脂多糖+生理鹽水組)誘導增加的Caspase-3活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TUNEL染色顯示,與生理鹽水+生理鹽水組相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠的心肌細胞凋亡水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低脂多糖(脂多糖+生理鹽水組)誘導的心肌細胞凋亡水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7。

A: Caspase-3活性相對水平; B: TUNEL陽性率; C: 細胞凋亡情況。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖7 各組小鼠心臟中Caspase-3活性以及細胞凋亡情況

3 討 論

心肌損傷導致的心肌功能障礙是膿毒癥所致多器官功能衰竭的嚴重并發(fā)癥之一。研究[8-9]報道, 20%～60%的膿毒癥患者有膿毒癥相關(guān)心肌損傷和心功能不全,并且病死率顯著高于未合并心肌損傷的患者[10]。膿毒癥休克是導致膿毒癥相關(guān)多器官功能障礙的始發(fā)因素,心血管功能障礙與膿毒癥休克的發(fā)生密切相關(guān)。目前,膿毒癥休克的治療方式以抗生素治療和支持治療為主。因此,尋找減輕膿毒癥心肌損傷、減少膿毒癥休克發(fā)生的新療法具有重要意義。

大車前苷是從車前草中分離的活性成分,屬于苯丙苷類糖苷。大車前苷具有明顯抗炎作用,大車前苷可以抑制脂多糖誘導的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT); 大車前苷還能抑制誘導的人氣道上皮細

與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖6 各組小鼠心臟中IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA相對水平

胞的炎癥反應(yīng)和急性肺損傷[11-12]。此外,大車前苷具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用[13-14]。本研究結(jié)果與上述研究一致,大車前苷可以顯著減少炎癥因子的產(chǎn)生,顯著降低心臟氧化應(yīng)激水平、心肌損傷標志物水平和減少心肌細胞凋亡,顯著改善小鼠的心功能。

膿毒癥相關(guān)的心肌損傷與心肌功能障礙的發(fā)生涉及多種機制,包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙以及凋亡等[15-17]。在膿毒癥的病理過程中,機體免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的炎癥因子,這些炎性細胞因子導致心肌周圍中性粒細胞的浸潤,損害 β-腎上腺素能信號傳導,擾亂能量代謝,使鈣穩(wěn)態(tài)失衡并刺激一氧化氮(NO)過量產(chǎn)生,最終會導致心肌損傷和心肌收縮力受損[18-19]。除免疫細胞外,心肌細胞本身也會在脂多糖刺激下產(chǎn)生IL-1β和 TNF-α 等炎癥因子[19]。這些細胞因子相互作用形成正反饋回路,導致炎癥反應(yīng)和心功能不全持續(xù)惡化。研究[20-21]表明,抑制炎癥反應(yīng)可以改善膿毒癥引起的心肌損傷。既往研究[11, 13, 22]發(fā)現(xiàn),大車前苷可減輕炎癥反應(yīng),發(fā)揮對脂多糖誘導的急性肺損傷、氣道上皮細胞損傷以及高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),大車前苷可以抑制脂多糖誘導的心肌損傷模型中TNF-α、MCP-1、IL-1、IL-4以及IL-6相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平,從而發(fā)揮抗炎作用,減輕脂多糖對心肌的損傷。

氧化應(yīng)激是多種病理狀態(tài)包括感染性疾病中的關(guān)鍵過程。研究[23-24]證明,氧化應(yīng)激可能也是膿毒癥發(fā)病的核心過程。膿毒癥中活性氧(ROS)產(chǎn)生的關(guān)鍵部位是活化的中性粒細胞以及巨噬細胞。在整個炎癥過程中,這些細胞浸潤并釋放出大量的反應(yīng)性物質(zhì)[25]。多器官功能障礙綜合征是患有嚴重膿毒癥患者最嚴重的結(jié)果,其中細胞凋亡和壞死是介導器官衰竭的主要參與者,氧化應(yīng)激介導的線粒體通透性過渡孔(MPTP)的開放是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),可導致細胞凋亡和壞死的下游途徑激活,細胞發(fā)生死亡,進而導致器官衰竭[26]。本研究發(fā)現(xiàn),大車前苷可以在mRNA水平上恢復脂多糖導致降低的SOD-2、GPX-1以及CAT的表達,并且在心臟組織中檢測到MDA和4-HNE水平的降低。此外,大車前苷減輕了心肌細胞的凋亡,表現(xiàn)為Caspase-3的活性顯著降低, TUNEL染色細胞陽性率顯著降低。

綜上所述,大車前苷可以減輕脂多糖誘導的小鼠心肌細胞損傷,改善心功能。這可能與大車前苷抑制脂多糖所致的炎癥、氧化應(yīng)激以及凋亡相關(guān),但具體的作用機制仍需進一步驗證。