小鼠成骨細胞對高加速度力學微環境的彈性響應＊

楊文凱 王 鑫

（1.天津理工大學天津市先進機電系統設計與智能控制重點實驗室，天津 300384；2.機電工程國家級實驗教學示范中心（天津理工大學），天津 300384）

0.引言

在載人航天器的發射與返回、現代高性能戰斗機的起飛與降落等國家重大軍事行動和科研探索的過程中，航天員和飛行員經常會暴露于高加速度的極端力學環境中[1]，所承受的重力加速度往往超出正常環境的幾倍[2]，而當碰到一些特殊情況如飛船應急逃逸、緊急返航或是宇航員訓練過程時，所承受的重力加速度則會達到近10 倍[3]。

骨骼作為維持人體生命的重要器官之一，是身體對機械負荷的主要承擔結構，是構成機體運動系統的核心部分[4]。在正常的骨組織中，三類細胞即成骨細胞、破骨細胞以及骨細胞各司其職、各謀其政，在特定的力學微環境中，維持著骨組織的重建與吸收的動態平衡。人體組織均具有一定的力學微環境適應性，對于骨組織來說，成骨細胞能夠感受外在力學載荷，并對其做出相應的力學響應，主要負責骨組織的重建[5]。成骨細胞主要負責骨基質的合成、分泌和礦化，是骨形成的主要功能細胞[6]。力學環境對控制和影響骨重建與骨吸收起到了至關重要的作用[7]。力學環境是控制和影響骨重建的重要因素。在生理狀態下，骨處于最佳力學環境中，骨吸收和骨形成之間是一種動態平衡。當骨的力學環境變化時，動態平衡隨之改變，骨的組織、細胞也發生相應的變化，通過骨吸收和骨形成，最終在新的基礎上達到新的平衡。成骨細胞和破骨細胞的動態平衡維持了體內的骨量，機械應力刺激則是其平衡的重要調節因素，在骨重塑和吸收過程中發揮著至關重要的作用。

本文采用小鼠成骨細胞（MC3T3-E1）作為細胞模型。細胞按加速度力學加載分為1G、5G、10G、20G、40G 和100G 組，以不加載細胞為對照組。利用之前研發的力學加載裝置對細胞進行加載，采用頻率為連續3d，每天30min，從而模擬高加速度力學微環境，進而研究力學因素在骨組織重建過程中所起到的關鍵性作用。利用原子力顯微鏡對細胞進行納米壓痕實驗，使用經典赫茲接觸力學模型擬合細胞加載曲線，進行細胞的彈性模量，得出細胞的彈性性質。結果表明，在5G 加速度力學微環境下，細胞的彈性響應有所增強，對應于細胞核和細胞質區域的細胞骨架重排。本文的研究結果為組織工程中研究高重力力學微環境下骨組織的力學生物學響應提供了可靠的理論依據。

1.材料和方法

1.1 小鼠MC3T3-E1 的培養方法

細胞培養液為含有10%胎牛血清（Gibco，USA）的-MEN培養液（Gibco，USA），使用0.25%胰蛋白酶（Trypsin，Gibco，USA）消化細胞，在消化細胞之前用磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio，CHINA）沖洗細胞。

1.2 細胞實驗分組及加載方法

細胞按加速度力學加載分為1G、5G、10G、20G、40G 和100G 組，以不加載細胞為對照組。利用之前研發的力學加載裝置對細胞進行加載，采用頻率為連續3d，每天30min，從而模擬高加速度力學微環境，進而研究力學因素在骨組織重建過程中所起到的關鍵性作用。

課題組設計了一款細胞離心式加載機，該細胞離心式加載機可以利用實驗室現有的培養條件和常用的培養細胞容器，對細胞進行離心高加速度加載。加載機內部轉子采用了凹槽設計，使25cm2的細胞培養瓶和直徑小于60mm 的培養皿都可固定于轉子體兩側凹槽內。為探究高加速度力學環境對成骨細胞的生化影響，我們使用離心式加載機模擬細胞處于高加速度力學環境中。首先將細胞分為對照組、1G 組、5G 組、10G 組、20G 組、40G 組和100G 組，計算出各組對應的轉速。在實驗過程中對照組除加載實驗外與實驗組做相同處理。使用預先研發的實驗設備進行加載，連續3d，每天30min，模擬成骨細胞處于高加速度力學微環境中，對照組同步置于除加載外相同的培養環境中，研究力學因素在骨組織重建過程中的作用。

1.3 AFM 彈性屬性表征

本實驗室所使用的原子力顯微鏡是BioScope Resolve AFM（Atomic Force Microscopy，Bruker）。對MC3T3-E1進行形貌高分辨表征以及力學屬性表征時，細胞均置于細胞培養液中，且使用加熱臺保持液體溫度維持在37℃左右。AFM 所使用的探針為PFQNM-LC-A-CAL（Bruker），彈性系數k=0.1N/m，探針尖端為球形，R=65nm。實驗的工作模式為PeakForce QNM in Fluid，對細胞進行高分辨掃描，從而得出細胞的形貌圖，進而區分細胞核與細胞質區域，然而，轉換為Force Volume 模式，對每個區域做3 ～5 組力曲線，每組32×32 條，最后采用經典赫茲接觸力學模型擬合細胞加載曲線，進行得出細胞的彈性模量，得出細胞的彈性性質出模量圖。

1.4 結果

根據Hertzian 理論公式：

可知在外載荷作用下，細胞的力學響應與探針的半徑、剛體壓入細胞的深度、細胞泊松比和彈性模量有關。F為探針對細胞的作用力，E為單個MC3T3-E1 的彈性模量，R為探針的針尖半徑（～65nm），δ為探針的壓入深度，ν為MC3T3-E1 的泊松比（等于0.5）。

圖1 為MC3T3-E1 的彈性模量值結果，MC3T3-E1在受到高加速度加載后，細胞核區與細胞質區的彈性模量屬性均會發生變化，且變化趨勢不盡相同。在細胞核區，低加速度作用（1G、5G、10G），MC3T3-E1 的彈性模量與對照組相比變化不大（2 ～2.3kPa），但是當加速度加載達到20G 及其以上時，核區的彈性模量值有所下降（小于2kPa），當加速度加載達到100G 時，核區的彈性模量=0.85kPa。高加速度加載對細胞質區的影響則更為顯著。基于AFM 實驗結果，MC3T3-E1 在1G 的加速度加載后，質區的彈性模量開始增大，當高加速度=5G 時，質區彈性模量 = 6.55kPa；而當高加速度加載超過10G后，質區彈性模量開始降低，甚至低于對照組，當高加速度加載=100G 時，質區的彈性模量=2.28kPa。細胞核區域的彈性力學屬性較細胞質區域軟。

圖1 高加速度加載后細胞核以及細胞質區域彈性模量結果

2.結論

生物力學問題與人類生命健康密切相關，已經成為近年來力學、物理學、生命科學和醫學等學科所關注的交叉學科熱點問題。原子力顯微鏡是近年來在納米探測領域崛起的新型探測工具，它逐漸克服了對生命體組織和細胞等樣品的探測難題，憑借其簡便高效的檢測方法迅速成為納米生物科學中使用最廣泛的儀器設備，受到了許多研究者的青睞。對于高加速度力學環境下生物組織如何響應，成骨細胞如何變化的研究一直停留在對于這些組織和細胞的生化響應方面。本研究利用新型儀器原子力顯微鏡測量了經過高重力加速度加載后，成骨細胞表面彈性模量的變化，從成骨細胞對于高加速度力學微環境的力學響應做出了研究。

在骨所處的力學環境中，成骨細胞不但是骨形成過程中的主要功能細胞，也是骨感受外界刺激和力學載荷的主要細胞，成骨細胞對外界力學刺激的響應很敏感。本課題采用跨尺度方法對高加速度力學加載條件下成骨細胞所產生的力學生物學影響進行了較為深入的研究，采用AFM表征了高加速度加載后細胞的形貌以及力學屬性，這與本課題前期采用MTT 實驗表征細胞增殖能力，Western blot 實驗檢測力學加載條件下成骨細胞沿骨向分化目標蛋白的表達，共聚焦熒光顯微鏡顯示細胞骨架以及鋪展面積的變化等結果均妥合。從實驗結果中來看，重力加速度對細胞表面的硬度有明顯的影響，但是對細胞核區域和細胞質區域的影響又略有不同。在低重力加速度（1G、5G、10G）加載后，相比于對照組來說，細胞核區域的楊氏模量并未發生明顯變化，但是細胞質區域楊氏模量有明顯的增大；在高重力加速度（20G、40G、100G）加載后，細胞核區域和細胞質區域的楊氏模量均下降，且加速度值越大，楊氏模量下降越大?？梢缘贸?，適當的力學會提高成骨細胞MC3T3-E1 的力學響應，然后過度加載會降低成骨細胞的力學適應性，甚至導致影響細胞的功能性，導致細胞凋亡。