金黃色葡萄球菌對萬古霉素的耐藥性及耐藥基因檢測分析

李倫，張麗娜，王兵，劉彩林

金黃色葡萄球菌（SA）是臨床常見的致病菌，隨著1961 年英國首次發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）至今，MRSA 檢出率急劇上升，已成為臨床抗感染治療的一大難題［1］。萬古霉素是治療MRSA 感染最常用的藥物和最后防線［2］，然而隨著MRSA 感染率上升和萬古霉素的大量廣泛使用，萬古霉素敏感性降低的MRSA及萬古霉素治療失敗不斷被報道［3］。盡管按照美國臨床實驗室標準化研究協會的判讀折點，MRSA 對萬古霉素仍處于敏感范圍，但國內外均有大量研究報道萬古霉素異質性耐藥金黃色葡萄球菌（hVISA）和萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA），且近年來其檢出率呈上升趨勢，需引起臨床高度重視［4-5］。目前關于SA 對萬古霉素的具體耐藥機制尚不清楚，有研究發現菌種會通過基因調控方式來獲得適應力［6］，也有研究發現hVISA 和VISA 細胞壁相關代謝基因表達存在改變［7］。故本研究針對臨床送檢標本分離的SA 進行萬古霉素耐藥性檢測及基因檢測分析，以期為臨床合理治療控制感染提供參考依據，詳情如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源選取平頂山市第一人民醫院2020年4月至2022年3月臨床送檢樣本1 592例，分離出288株SA菌株（均為首次分離），檢出率18.09%。SA樣本來源：膿液173 份（60.07%）、血液34 份（11.80%）、胸腹水32 份（11.11%）、引流液26 份（9.03%）、痰液23份（7.99%），去除重復菌株。

1.2 抗菌藥物及培養基萬古霉素抗菌藥物、Etest 實驗條、血平板均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，腦心浸液瓊脂基礎和MH 瓊脂基礎由英國Oxoid 公司提供，脫纖維羊血購自鄭州農達生物制品有限公司。

1.3 SA 鑒定及抗菌藥物敏感性檢測試驗SA 菌株經MH 瓊脂培養后挑選單個菌落，經革蘭染色和觸酶試驗證實后用傳統劃線法接種于瓊脂培養基上進行分離純化，用法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定和藥敏儀器及紙片擴散法進行菌株鑒定與藥物敏感性試驗，SA 質控菌株為ATCC29213 和ATCC25923。采用E-test 法檢測萬古霉素最小抑菌濃度（MIC），按照美國臨床實驗室標準化委員會（2021 年CLSI M100-S31）推薦的方法進行操作，按CLSI規定的臨界值對藥物敏感性試驗結果進行判讀。

1.4 hVISA 的檢測方法用0.85%氯化鈉溶液將SA 菌株制備成濁度為0.5 麥氏的菌懸液，經胰蛋白胨大豆肉湯過夜培養后用無菌L棒將原液、1×10-3稀釋懸液、1×10-6稀釋懸液涂于萬古霉素濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L 的腦心浸液瓊脂平板上，35 ℃培養48 h，選取生長最好菌落的平板進行計數，并計算實際菌落數，實際菌落數=菌落計數×相應稀釋倍數。將Mu3 作為陽性對照，采用Graphpad Prism8.0 軟件繪制菌落數對數值對萬古霉素濃度的曲線，并計算曲線下面積，并與Mu3 比較，結果判讀：比值<0.9 判定為萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌（VSSA），比值≥0.9 且<1.3判定為hVISA，比值≥1.3判讀為VISA［8］。

1.5 基因檢測將SA 菌株接種在血平板上，采用德國QIAGEN 公司生產的Puregene Yeast/Bact 試劑盒提取RNA，采用QuantiTect Reverse Transcriptase試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作；采用實時定量聚合酶鏈反應檢測pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR 基因的表達，以16S RNA 作為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量，其中引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統計學方法采用SPSS 23.0 統計學工具處理數據，計量資料行正態性檢驗和方差齊性檢驗，均符合正態分布且方差齊，以±s形式描述，不同菌株耐藥基因相對表達量比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數、百分比形式描述，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MRSA 檢測結果及其對常用抗菌藥物敏感性檢測結果288 株SA 篩選出MRSA 菌株116 株（40.28%），甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）菌株172 株（59.72%）。MRSA 菌株和MSSA 菌株對利奈唑胺、替加環素、萬古霉素均敏感，見表2。

表2 MRSA和MSSA對常用抗菌藥物敏感性檢測結果/例（%）

2.2 hVISA 檢測結果288 株SA 共篩選出25 株hVISA菌株，hVISA陽性率為8.68%，其余263株SA均對萬古霉素敏感，未檢測到VISA菌株和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）菌株。E-test法檢測萬古霉素MIC，結果顯示VSSA菌株萬古霉素MIC主要分布在0.50 mg/L 和0.75 mg/L，占比為41.83% 和28.90%；hVISA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在1.50 mg/L和2.00 mg/L，占比為56.00%和28.00%，見表3。

表3 VSSA菌株與hVISA菌株萬古霉素MIC分布/例（%）

2.3 耐藥基因檢測結果VSSA菌株pbp4、agr、icaR基因相對表達量均明顯高于hVISA（均P<0.05）；VS?SA 菌株mgrA、vraS、vraR、icaA 基因相對表達量均明顯低于hVISA（均P<0.05），見表4。

表4 VSSA菌株與hVISA菌株耐藥基因相對表達量/± s

表4 VSSA菌株與hVISA菌株耐藥基因相對表達量/± s

注：VSSA 為萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌，hVISA 為萬古霉素異質性耐藥金黃色葡萄球菌。

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3 討論

自20 世紀80 年代起，萬古霉素逐漸成為治療MRSA 引起的重度感染的一線藥物，成為治療重癥SA 感染的重要保障。但隨著耐萬古霉素的腸球菌的出現，有學者認為SA很有可能從耐萬古霉素腸球菌中獲得vanA 耐藥基因進而對萬古霉素產生耐藥［9］，雖然至今尚未在SA 中檢測到vanA 耐藥基因，但隨著hVISA 和VISA 的出現，國內外陸續有關于萬古霉素治療SA的敏感性下降問題的相關報道出現。因此，檢測分析SA 對萬古霉素的耐藥基因的意義重大。

本研究對近兩年來臨床送檢樣本分離的288株SA 菌株進行耐藥性檢測，其中MRSA 菌株占40.28%，由此可見SA 對甲氧西林抗菌藥物的耐藥情況較為嚴重，分析其原因：MRSA 具有廣譜耐藥性，臨床檢出率較高可能與治療時不規范使用抗生素有關，且MRSA以定植或接觸傳播，消毒隔離不到位及免疫力低下、不注重手衛生病人均易引起MRSA 感染傳播，需引起臨床高度重視。hVISA 被認為是VISA 的前體，可能會進化為VISA，本研究通過藥物敏感性檢測發現：288 株SA 菌株檢出25 株hVISA 菌株，hVISA 陽性率為8.68%，表明SA 對萬古霉素存在一定的耐藥趨向。另外，本研究發現VS?SA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在0.50 mg/L 和0.75 mg/L，而hVISA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在1.50 mg/L 和2.00 mg/L，提示在萬古霉素高MIC 可能是發生SA 耐萬古霉素的征兆。近年來不斷有研究發現MRSA 分離株中萬古霉素MIC升高，均值從1.3 mg/L增加1.5 mg/L，并與治療失敗可能相關［10］，故臨床需高度重視。

目前，有學者認為SA對萬古霉素的耐藥性主要是由細菌的細胞壁增厚引起的［11］。既往研究在VI?SA 菌株中發現，walk 等基因發生部分突變會導致細胞壁代謝相關基因發生改變，使細菌的細胞壁增厚，藥物的敏感度被削弱［12］。劉明濤等［13］發現在大部分的hVISA 菌株中出現了walk 基因突變，且均為點突變，而walk 屬于walkR 二元信號系統，該系統可調控細胞壁代謝的上游基因atlA、ssaA、isaA、lytM，使其表達下調，從而減緩細胞壁的代謝，使細胞壁的厚度明顯增加，從而使細菌對萬古霉素的敏感度削弱，耐藥性上升。此外，SA 對萬古霉素的耐藥性增強還與ropB（編碼DNA 依賴的RNA 聚合酶亞單位）、graSR（編碼雙組分調節系統）等多處基因位點突變相關［5，14-15］。本研究據此通過篩選可能參與SA 發生萬古霉素耐藥的基因，并對比其在VSSA菌株和hVISA 菌株中的表達差異，發現VSSA 菌株pbp4、agr、icaR 的相對表達量均明顯高于hVISA 菌株，而mgrA、vraS、vraR、icaA 的相對表達量均明顯低于hVISA 菌株，提示上述基因可能介導hVISA 的轉化，并可能參與SA 耐萬古霉素的機制。pbp4 具有羧肽酶活性，參與了SA 細胞壁肽聚糖的二級交聯，pbp4 水平下降使肽聚糖交聯減少，致使萬古霉素易被D-丙胺酰-D-丙氨酸側鏈結合而被阻于細胞膜外，難以發揮抗菌活性，因而表現出對萬古霉素耐藥性［16］。agr 是存在于SA 的數量感應基因簇，其水平下調可促進菌體表面膜蛋白的表達，促進生物膜形成，有利于提升耐藥性。Chen 等［17］研究發現VSSA 向hVISA 轉換過程中，菌株會出現agr 基因C位點丟失，agr 水平下調，且既往也有研究報道hVI?SA 菌株中agr 功能缺失株的比例顯著高于VS?SA［18］，本研究與上述結果一致，均證實了hVISA 菌株中agr 的低表達，可能與萬古霉素耐藥有關。icaR 與生物膜的形成相關，且其水平與生物膜形成呈負相關［19］，在hVISA 中低表達利于SA 菌的細胞壁的形成，導致耐藥性強。劉彩林等［18］發現mgrA是一個與生物膜的形成呈正相關多效調節器，可激動8 型莢膜多糖，抑制蛋白a-毒素、凝固酶和蛋白酶等的活性，在hVISA菌株中的表達水平明顯升高，本研究與其結果均證實高表達的mgrA 對hVISA 菌株的耐藥性發揮促進作用。vraS 與vraR 共同組成vraSR磷酸轉移酶介導的信號調節系統，其可感應各種因素引起的細胞壁破壞，并快速應答，正向調節細胞壁的生物合成，增加細胞壁厚度保證細胞壁完整，兩者的表達水平上調均與hVISA菌株的細胞壁增厚密切相關［20］。icaA 是ica 操縱子第1 個基因，具有編碼N-乙酰葡糖胺轉移酶，促生物膜生成的作用，icaA 高表達會導致細胞壁厚度增加［21］，故猜測hVI?SA菌株中icaA表達量高會增厚菌株細胞壁，導致其對萬古霉素的耐藥性增強。

綜上所述，SA中hVISA陽性率為8.68%，SA對萬古霉素已存在異質性中介耐藥性，pbp4、agr、icaR 低表達與mgrA、vraS、vraR、icaA高表達均可能與hVISA株流行和萬古霉素耐藥性增強有關。本研究探討了SA 對萬古霉素的耐藥性及可能參與耐藥的基因作用，為進一步深入探討SA對萬古霉素耐藥的機制提供了重要的參考依據，具有重要的臨床意義。