納米顆粒介導的傳輸系統用于結直腸癌光動力治療的研究進展

楊全林，李耀平

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）主要是起源于結直腸表面黏膜上皮細胞的腺癌，現已成為第四大最常見和第三大最致命的惡性腫瘤［1-2］。對于晚期轉移病人，5 年生存率僅為6%左右［3］。手術切除是結直腸癌的主要治療方式，但手術切除可能會增加腫瘤擴散和轉移的風險；放療和化療是晚期結直腸癌轉移病人的治療策略，但因特異性差常產生副作用和耐藥［4-7］。此外，細胞治療、基因治療、免疫治療和靶向治療在結直腸癌治療中也表現出了突出的潛力，但這些策略的成本和系統毒性常會限制其應用［8］，因此，迫切需要探索一種新型的非侵入性、對腫瘤細胞具有高度選擇性和對正常組織最小毒性的治療策略應對這些挑戰［9］。光動力療法（photo?dynamic therapy，PDT）是一種很有前途的抗癌治療方法，具有相對快速和準確的腫瘤殺傷特性［10-11］，已成為CRC 抗癌治療的一種新的替代干預手段［12］，受到了廣泛的關注。本研究就光動力療法的原理、納米顆粒在結直腸癌光動力療法中的應用展開綜述。

1 PDT

PDT是基于使用適當波長的光照射并激活定位于腫瘤組織或細胞中的光敏劑分子，通過光敏劑分子活化在腫瘤局部產生多種活性氧，活性氧能夠啟動氧化細胞破壞，并通過壞死、凋亡、自噬，以及產生腫瘤特異性免疫等機制殺死腫瘤細胞［13-15］。與目前常規治療方式相比，PDT 的特異性依賴于：（1）定位于腫瘤細胞的光敏劑；（2）精確且適宜波長的光激活光敏劑；（3）光敏劑活化后腫瘤周圍分子氧含量［16］；即PDT 療效取決于光敏劑、分子氧和光活化的結合［17］。其中，光敏劑的定位及聚集尤為關鍵。在臨床腫瘤學領域，已有多種PDT 方案被常規使用［18-19］，但由此也暴露出PDT 過程中的一些缺點：（1）治療中常用的光敏劑常為疏水分子，不易于癌腫富集；（2）使用現有光敏劑進行治療后存在一定時間的皮膚光敏性，須采取避光措施；（3）光敏劑缺乏靶細胞特異性；（4）常規光照（600~700 nm）光線穿透有限，未能直達腫瘤部位［12，15］。因此，研究新的光敏劑和新的給藥方法仍然是當前的挑戰，納米顆粒介導的光敏劑傳遞系統應運而生。

2 納米顆粒（nanoparticles，NPs）

NPs可以被視為是原子、分子或離子的集合，大小通常介于1~100 nm，且往往具有較大的表面積與體積比［20］。根據組成、大小和形狀的不同，通常將其分為硬納米顆粒和軟納米顆粒［21］，即無機納米顆粒和有機納米顆粒。研究發現，納米顆粒主要通過被動靶向及主動靶向介導傳遞過程［22］。目前，用于輔助CRC 治療藥物傳遞的無機納米顆粒包括金屬、金屬氧化物、碳、量子點（quantum dots，QDs）、二氧化硅等，有機納米顆粒包括脂質體、聚合物膠束、樹突分子、聚合物NPs和聚合物共軛物等［20，22-23］。在過去幾十年里，NPs 由于其獨特的物理化學和生理特性，受到了廣泛的關注，作為一種獨特的納米載體，已被證實在納米診斷、納米治療及再生醫學中應用廣泛［24］。有研究［25］表明，使用NPs 作為載體進行藥物遞送具有以下優勢：（1）規避抗癌藥物的溶解度和穩定性問題；（2）防止藥物被蛋白酶和其他酶降解，并增加藥物在體循環中的半衰期；（3）改進藥物的分布和針對性；（4）通過靶向定位幫助藥物持續釋放；（5）幫助多種藥物的遞送，有助于降低耐藥性。這些優勢的存在彌補了PDT 過程中的關鍵不足。NPs超大的表面體積比可以增加其與光敏劑的表面相互作用并提高其承載能力，從而改善光敏劑傳遞濃度，增強癌細胞的被動或主動攝取，便于光敏劑在癌細胞內富集；此外，以NPs 為載體，將光敏劑錨定在NPs 上，可以提高光敏劑的穩定性和溶解度，減少光毒性和增強靶向細胞的光敏劑傳遞，改善PDT 治療效果，減少不必要的副作用［15，26］。這為納米顆粒介導的傳輸系統在結直腸癌光動力治療中提供了理論支撐。

3 納米顆粒介導的傳輸系統與結直腸癌光動力治療

3.1 無機納米顆粒

3.1.1貴金屬 自古以來，貴金屬納米顆粒就被用于治療麻疹和潰瘍等疾病。相較于用于電子和半導體鄰域的大多數金屬納米粒子，貴金屬納米粒子已廣泛應用于醫學領域。銀的殺菌特性、金化合物的抗癌特性以及含鉑化療藥的抗癌性使得它們在納米醫學領域備受追捧［20］。De Freitas 等［27］制備了以銀納米顆粒（AgNPs）為傳導系統，由殼聚糖（CHT）和硫酸軟骨素（CS）封存光敏劑姜黃素（CUR）組成的水凝膠，他們發現，水凝膠對健康組織無細胞毒性，確保了應用的安全性。同時在含有9.2 mg/L的CUR的水凝膠中，AgNPs 介導的光活化可導致Caco-2 人結腸癌細胞的高死亡率（CC50=91.5 mg/L），表明Ag?NPs介導的PDT 促進了細胞的選擇性并增強了其治療效果。Simelane 等［28］制備了以聚乙二醇化、硫代硫酞菁鋅（ZnPcS4）功能化的金納米顆粒（AuNPs）為基礎，與抗鳥苷酰環化酶C（GCC）單克隆抗體（mAbs）偶聯，具有多功能腫瘤靶向生物活性的納米偶聯物（ZnPcS4-AuNP-S-PEG5000-NH2-Anti-GCC mAb，BNC）進行研究，結果表明與健康的體外培養細胞相比，BNC 具有光穩定性，并可靶向的在CRC中顯示出選擇性，并改善其亞細胞積累。此外，與單獨給予PDT 光敏劑（15%，P<0.05）相比，BNC PDT誘導的CRC 細胞晚期凋亡形式的死亡率顯著更高（34%，P<0.001）。上述結果表明，PDT 結果的改善是由于NP載體和具有生物活性的抗GCC 抗體的PS在體外培養的CRC 細胞內特異性積累所致。因此，BNC 平臺可改善PDT CRC 的治療，且由于其靶向能力，可作為CRC 早期診斷的補充措施。Mirrahimi等［29］開發了一種由海藻酸鈉納米凝膠與順鉑金納米顆粒（ACA）共載的新型多功能納米平臺，研究發現，ACA 納米復合物具有良好的穩定性，在532 nm 激光照射下，與其他組相比（激光單獨照射和游離順鉑化療），PDT和相同順鉑濃度下ACA納米復合物化療引起的抑制率顯著更高，分別為73%和81%，而納米復合物的化學-光動力療法的聯合作用顯著地抑制了95%的腫瘤生長，并顯著延長了攜帶CT26結直腸腫瘤模型小鼠的存活率。表明該納米復合物具有較強的抗癌作用，聯合化療藥物使用可增強其治療效果，且可減少藥物高劑量所引發的相關副作用。

3.1.2碳及二氧化硅 Sundaram、Abrahamse［30］將單壁碳納米管（SWCNTs）與涂在SWCNTs 壁上的透明質酸（HA）和氯離子e6（Ce6）偶聯，合成了一種由Ce6 包被透明質酸偶聯的SWCNTs 組成的納米生物復合材料，采用PDT，分別在660 nm 波長處5 J/cm2和10 J/cm2的劑量下測試了納米生物復合材料對結腸癌細胞的毒性，研究發現，與單獨使用Ce6 相比，使用合成的納米生物復合材料具有更高水平的細胞毒性；在細胞死亡分析（流式細胞術）中，結果表明，與對照組相比，納米生物復合材料和PDT（5 和10 J/cm2激光輻照）的聯合作用在早期和晚期細胞凋亡中都發揮了顯著的作用，且10 J/cm2組（41.9±6.65）早期凋亡細胞數較5 J/cm2組（36±6.4）增加，說明SWCNTs的納米生物復合系統表現出優異的光敏劑傳遞性能。Wu 等［31］制備了一種將黃芪甲苷Ⅲ（AstragalosideⅢ，As）和試劑氯（Ce6）共載于聚乙二醇化的二氧化硅納米顆粒微球平臺，該平臺可同時促進CT26 結腸癌細胞的先天免疫和適應性免疫治療。作為免疫激活劑、光敏劑和顯像劑，As 和Ce6被加載到聚乙二醇化二氧化硅微球中，在660 nm 激光照射下，PDT可誘導腫瘤細胞凋亡，釋放腫瘤相關抗原誘導適應性免疫反應，誘導NK 細胞進入腫瘤微環境。另一方面，由于腫瘤內轉錄因子的高表達，通過As 激活NK 細胞增強固有免疫反應，刺激CD8+T 細胞γ 干擾素（IFN-γ）的產生，抑制腫瘤的發展。Bouramtane等［32］合成了一種由二氧化硅核和攜帶5-（4-羥基苯基）10，15，20-三苯基卟啉（TPPOH）殼的木聚糖組成的核-殼雜化納米粒子（PX SNPs），研究表明，兩種化合物在黑暗中對細胞無毒，與游離的TPPOH 相比，當光敏劑被630~660 nm 紅光照射時，PX SNPs 對結直腸癌HCT116 細胞和HT-29 細胞的細胞殺傷效率分別提高了40倍和10倍。

3.2 有機納米顆粒

3.2.1脂質體及膠束 Xu等［33］制備了以PH 敏感脂質體為外殼，封裝線粒體靶向光敏劑TPPP（與三苯基膦（TPP）配體結合的原卟啉-IX）和天然環肽RA-Ⅻ（結腸癌化療藥物），外嵌透明質酸（HA）的脂質體納米顆粒RA/TPPP-Lip，體外實驗結果顯示：TPPP在用660 nm 激光照射下產生細胞毒性活性氧，直接損傷細胞線粒體，與其他各組相比，RA/TPPP-Lip 聯合激光照射組凋亡細胞比例增加（30%），活細胞比例下降（29.3%）。RA/TPPP-Lip 組凋亡細胞數量與RA-lip 組和TPPP-Lip 聯合激光組相似，表明RA/TPPP-Lip 聯合激光處理HCT116 細胞的凋亡程度明顯高于其他各組；同時利用HCT116 細胞異體皮下移植構建腫瘤模型，發現RA/TPPP-Lip 在裸鼠腫瘤部位大量積累，并有效抑制腫瘤生長。綜上，納米治療平臺RA/TPPP-Lip 通過聯合化療和光動力治療，大大提高了結腸癌細胞的殺傷效率。Chiarante等［34］將親脂性光敏劑酞菁鋅Ⅱ（Pc9）整合到泊洛沙明表面活性物質?1107（T1107）中，形成Pc9-T1107聚合物膠束，實驗發現，與對照組（未注載體且未經輻照或注射載體未經輻照或未注射載體僅輻照）相比，經輻照的Pc9-T1107治療小鼠的腫瘤體積顯著降低，同時輻照Pc9-T1107 處理的小鼠的存活率顯著高于對照組（P<0.05），表明Pc9-T1107有效地延緩了腫瘤生長，延長了小鼠存活時間，且沒有產生系統或組織特異性毒性。Guo 等［35］將光敏劑鋅酞菁（ZnPc）通過不耐酸的腙連接劑與阿霉素（Dox）偶聯，在缺氧活化的前藥替拉扎明（TPZ）存在和不存在的情況下，通過聚乙二醇和聚DL-丙交酯嵌段共聚物的自組裝，將所得的ZnPc-dox 偶聯物封裝成聚合物膠束，分別生成ZnPc–Dox 膠束和ZnPc-dox/TPZ 膠束。他們發現Dox 和/或TPZ 的化療作用，這些膠束在黑暗中對HT29 細胞有輕微的細胞毒性。在610 nm 的光照射下，ZnPc–dox膠束的細胞光毒性遠高于游離的ZnPc–dox，在Dox 1 μmol 的ZnPc， ZnPc-dox 和單純膠束分別誘導了20%和60%的細胞死亡，而ZnPc-Dox膠束誘導了80%的細胞死亡。結果表明，將ZnPc-Dox包埋在聚合物膠束中可顯著促進細胞吸收，從而增強細胞光毒性，有效殺死腫瘤細胞。

3.2.2聚合物NPs 及共軛聚合物 Deng 等［36］開發了一種線粒體靶向生物可降解聚合物（乳酸-乙醇酸）納米載體（PLGA），其中包括光敏劑維替泊芬（VP）、超小（2~5 nm）金納米顆粒作為X 線輻射增強劑，以及三苯基膦（TPP）作為線粒體靶向部分。研究發現與對照組（非靶向PLGA）相比，X-PDT（4 Gy）處理后HCT116 結直腸癌凋亡細胞數從（5.3±1.8）%增加到（37.4±4.7）%。相比之下，單獨使用納米顆粒和X 射線治療后，分別僅檢測到（8.9±2.9）%和（7.8±3.5）%的凋亡率。在帶有人類HCT116 結直腸細胞的小鼠體內實驗發現，與其他治療條件相比，暴露于這種聯合治療的小鼠的生存期顯著增加（log-rank檢驗，P=0.002，對照組；P=0.002，4 Gy；P=0.003，PLGA-TPP；P=0.049，8 Gy），結果表明，納米顆粒介導X 射線輻射聯合光動力療法（PDT）在深層組織具有良好的治療效果，可延長小鼠存活時間。Lin等［37］制備了用乙交酯丙交酯共聚物（PLGA）封裝光敏劑二氫卟啉e6（Ce6）的PLGA-Ce6 納米顆粒，用于結直腸癌細胞的研究，結果發現，Ce6 在PLGA 納米顆粒包封中表現出良好的穩定性，在結直腸癌HCT-116 細胞系中，PLGA-Ce6 NPs 對HCT-116 細胞表現出增強的光毒性，且在HCT-116 細胞中的IC50值略低于單獨使用Ce6 溶液。與純藥物相比，PLGA-Ce6 NPs 對HCT-116 球形細胞的穿透更深，具有更好的光毒性。這些結果提示PLGA-Ce6 NPs 介導的PDT可能作為結直腸癌的治療方式。Ibarra 等［38］利用共軛聚合物9，9-二辛基聚芴-苯并噻二唑（F8BT）和兩親性共聚物穩定劑（PS-PEG-COOH）封裝有機疏水PS-八乙基鉑卟啉（PtOEP）合成了共軛聚合物納米粒子（CPNs），研究發現，在結直腸癌SW480 細胞系中，其對細胞系的整體細胞形態及功能無影響，經其處理可有效誘導氧化應激，進而引發細胞凋亡，成為細胞死亡的主要機制。同時發現，相對低劑量的光敏劑（IC50=6~28 mg/L）和光照（10 J/cm2）可以使50%的細胞群體死亡，表明CPNs納米顆粒具有極高的粒子吸收截面和可觀的活性氧生成率，為結直腸癌PDT提供了一個合適的治療平臺。

4 總結與展望

結直腸癌（CRC）是一種常見的消化系統惡性腫瘤，是全球第三大癌癥相關死亡原因［39］，手術切除是結直腸癌的主要治療方法。放療、化療、免疫治療等是晚期結直腸癌轉移病人的治療策略，但往往存在嚴重的副作用。PDT 因其腫瘤選擇性高、組織損傷小、可重復操作性強、全身不良反應少等優點已被運用于臨床研究［40］，但在成功的PDT 聯合臨床試驗方面，目前尚無關于CRC 的報道［13，41］。已有大量的實驗研究表明，基于納米顆粒介導的PDT 在結直腸腫瘤細胞株中的效果不可小覷，或將成為結直腸癌的有效治療方法之一。

目前國內外仍在探索PDT 殺傷CRC 細胞的潛在機制，尋求增強PDT 治療效果的藥物遞送系統，而納米顆粒介導的傳輸系統就此表現尤為突出。但值得注意的是，NPs的制備及轉化需要一種高效、簡單、穩定、成熟、經濟、環保的合成模式，NPs 進入人體后的生物分布、藥代動力學、組織相容性、免疫原性、重金屬大量蓄積的毒性、是否致癌等問題依舊需要關注，另一方面，基于納米顆粒介導的傳輸系統需要特殊的設備、場地及人員配給，這對一些機構仍是挑戰。未來需要構建更多可以模擬人類生理環境中腫瘤特征的3D模型，更真實地預測納米顆粒聯合PDT 在體外和體內的治療效果，相信隨著科技的發展，納米顆粒介導的傳輸系統在結直腸癌光動力治療中會有更廣闊的應用前景。