養殖水體中甲苯咪唑的動態消除規律研究

錢卓真，李雷斌，劉智禹，湯水粉，王麗娟，姜琳琳，陳宇鋒，位紹紅，余 穎，劉海新，陳 思，羅方方

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，海洋生物種業技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361013)

甲苯咪唑(Mebendazole，MBZ)是一種用于治療人和動物體內各種寄生蟲的苯并咪唑類驅蟲藥，以及用于對抗蠕蟲，如鉤蟲、鞭蟲和蛔蟲等[1]，結構見圖1。它通過阻斷蟲體腸細胞漿微管的形成和營養吸收而發揮作用。自1998年被發現具有良好的治療平鲉單殖吸蟲效果[2]后，MBZ逐步被應用于水產寄生蟲的驅殺[3]，實踐結果也證明其具有良好的殺蟲效果[2，4-6]。然而，MBZ及其代謝物對人類和動物具有潛在毒性，并已被證明對哺乳動物具有致畸作用[7-8]。我國也曾報道過多例使用MBZ引起的腦病綜合征病例，引起了人們對MBZ的關注[9]。鑒于MBZ的毒性作用，歐盟和國際食品法典委員會發布了相應的安全標準，用于監測動物食品中的MBZ殘留；美國食品藥品監督管理局禁止其在孕婦人群中及動物懷孕期間被使用。同樣，我國也對動物源性食品中MBZ殘留作出了相應的規定，MBZ在羊、馬的肌肉和脂肪的最大殘留限量(Maximum residue limit，MRL)為 60 μg/kg，在肝臟、腎臟中的MRL分別為400 μg/kg和60 μg/kg[10]，這與歐盟標準一致。

雖然 MBZ 已經在水產養殖中批準使用，但由于缺乏完善的相關藥代動力學研究的基礎數據，我國并未規定MBZ在魚組織中的MRL。目前，國內有關MBZ的藥代動力學研究不多，僅見在鯽(Carassiusauratus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)、鰻鱺(A.japonica)等魚類，給藥模式也集中在口灌和浸浴兩種方式。潘浩等[11]以連續3 d單劑量口灌20 mg/kg(體質量)MBZ的給藥方式，研究其在鯽體內的吸收及殘留消除規律，結果表明其藥時關系符合一級吸收二室開放模型，建議休藥期為25 d，但該種模式并不符合實際養殖用藥方式，對實際生產的指導意義不大。廖碧釵等[12]采用浸浴(1 000 μg/L)方式開展了MBZ及其代謝物在歐洲鰻鱺體內藥物動力學及殘留研究，結果表明MBZ在各組織中的殘留量及消除速度差別較大，建議休藥期不低于48 d。李忠琴等[13]報道了在水溫20℃、1 000 μg/L MBZ藥浴后，鰻鱺體內的藥物代謝及組織殘留情況，雖然該浸浴方式與實際養殖給藥方式(全池潑灑)基本相似，但研究忽略了用藥時間。為了保證MBZ的藥效，實際養殖中MBZ的使用建議為5 d不換水。而受養殖條件的限制，某些養殖戶對養殖對象的用藥時間可能持續更久。

浸浴藥物濃度是影響藥物代謝研究的關鍵參數[14]，因此實際養殖水體中MBZ的含量變化與魚組織中MBZ殘留量息息相關。本文結合實際養殖用藥方式，進一步研究了長期暴露于MBZ下的養殖水體中MBZ的動態消除規律，以期為水產養殖動物中MBZ的藥代動力學研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MBZ、MBZ-d3標準品(純度99%)，德國Dr.Ehrensorfer公司；上述標準品分別用甲醇溶解定容至10 000 μg/L標準儲備液，-18℃避光保存，有效期為12個月；用甲醇分別稀釋標準儲備液至1 000、100 μg/L MBZ標準中間液，以及100 μg/L MBZ-d3標準中間液，4℃避光保存，有效期為6個月。

MBZ原粉(純度98%)，上海安譜科學儀器有限公司；吐溫80，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、甲酸、乙酸乙酯(均為色譜純)，美國Tidea公司；濃氨水(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；0.22 μm尼龍微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

定容液配制：0.1%甲酸水溶液65 mL，加入甲醇35 mL，混勻，置于4℃冰箱中備用。

1.2 儀器與設備

TSQ QUANTUMULTRA高效液相色譜-串聯質譜儀(HPLC-MS/MS)，美國Thermo-Fisher Scientific公司；AB204-E型、PL203型電子分析天平，美國Mettler Toledo公司；R系列旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司；MS3渦旋振蕩器，德國IKA公司；KQ3200E超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q型超純水儀，美國Millipore公司。

1.3 實驗條件

為了更好地模擬重現實際養殖條件，冬季在戶外圍隔池塘開展海水中MBZ消除實驗。實驗水體溫度為15～18℃，實驗用水為曝氣 48 h的海水，連續充氧，保持水中溶解氧濃度大于5.0 mg/L，pH為6.8～7.5。實際日照天數為27 d，日照時數為6～7 h/d，光強為冬季自然日照強度。

1.4 試樣采集

低濃度組(15 μg/L)：稱取 0.3 g MBZ 原粉，加入10 mL甲酸，置渦旋振蕩器上振蕩，使 MBZ 充分溶解在甲酸里，加入 20 mL 吐溫 80，再加水稀釋至 500 mL。使用時潑灑至盛有20 m3曝氣水的室外實驗池中，并連續充氧，水溫為15～18℃，pH值約6.8。

高濃度組(50 μg/L)：稱取 1.0 g MBZ 原粉，加入25 mL甲酸，置渦旋振蕩器上振蕩，使 MBZ 充分溶解在甲酸里，加入 60 mL 吐溫 80，再加水稀釋至 500 mL。使用時潑灑至盛有20 m3曝氣水的室外實驗池中，并連續充氧，水溫為15～18℃，調節pH值至6.8。

對照避光組(15 μg/L)：稱取 0.015 g MBZ 原粉，加入0.5 mL甲酸，置渦旋振蕩器上振蕩，使 MBZ 充分溶解在甲酸里，加入 1 mL 吐溫 80，再加水稀釋至 25 mL。使用時潑灑至盛有1 m3曝氣水的室外實驗池中，池口用鋁箔封住避光，并連續充氧，水溫為15～18℃。

采樣：在潑灑MBZ后的 0、72、120、168、216、288、384、504、648 h，各采集1份水樣。

1.5 樣品前處理方法

取50 mL水樣于250 mL分液漏斗中，加入100 μL 100 μg/L MBZ-d3內標溶液，混勻后再加入濃氨水調節pH至中性；再加50 mL乙酸乙酯，振蕩混勻 1 min，靜置分層后取上層萃取液于雞心瓶中，重復振蕩提取2次，再合并上層萃取液于雞心瓶中；40℃下減壓旋轉蒸發至干。1 mL 定容液超聲溶解1 min，經 0.22 μm 尼龍微孔濾膜過濾，HPLC-MS/MS 測定。

1.6 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：Hypersil Gold-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×3 μm)；柱溫30℃；流速0.25 mL/min；進樣量10 μL；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；洗脫梯度：0～0.2 min(35%～50% B)、0.2～3.0 min(50%～65% B)、3.0～6.6 min(65% B)、6.6～7.0 min(65%～35%B)、7.0～12.0 min(35% B)。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子檢測模式，霧化室加熱溫度：150℃，噴霧電壓：3 500 V，鞘氣壓力：267 kPa，輔助氣壓力：5 L/min，離子傳輸毛細管溫度：350℃，選擇反應監測模式(SRM)，MBZ監測離子為296→77(碰撞能量28 eV)和296→105(碰撞能量29 eV)，MBZ-d3監測離子為299→105(碰撞能量32 eV)，Q1半峰寬：0.7 u，Q3半峰寬：0.7 u，碰撞氣壓力：氬氣、0.2 Pa。

1.7 質量控制

先依據保留時間和特征離子，準確地計算標準曲線，再進行樣品定量分析。移取適量標準溶液，用定容液分別配制成不同質量濃度標準溶液，目標物濃度分別為0.5、2.5、5.0、25、50、100、200 μg/L，內標MBZ-d3質量濃度為50 μg/L。本方法采用內標法定量，以標準溶液質量濃度為橫坐標、目標物和內標物的峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線[15]，求回歸方程和相關系數。

以實際養殖水體為研究對象進行標準添加實驗，分別以低(0.5 μg/L)、中(5.0 μg/L)、高(20.0 μg/L)三個添加水平進行加標回收實驗，每個濃度水平做6 次平行實驗，考察方法的準確度及日內精密度，并連續6 d測定中等添加水平的加標回收率，考察方法的日間精密度。

1.8 計算公式

光降解率r計算公式：

式中，C0是水體中MBZ初始濃度，μg/L；Ct是時間t時水體中MBZ的殘留濃度，μg/L。

2 結果與討論

2.1 檢測方法的實用性

以10倍信噪比(S/N)計算定量限(Limit of quantitation，LOQ)，養殖水體中 MBZ定量限為0.5 μg/L。在0.5～200 μg/L線性良好，標準曲線為：y=0.333 790x+0.243 444，R2>0.99。MBZ在0.5 μg/L添加水平下，回收率為70.6%～91.9%，日內變異系數在7.60%～8.63%之間；在5.0 μg/L添加水平下，回收率為70.8%～92.1%，日內變異系數在6.70%～9.65%之間；在20.0 μg/L添加水平下，回收率為84.5%～107%，日內變異系數在7.57%～8.27%之間。在3個濃度添加水平下，日間變異系數≤10%(表1)。MBZ定量和定性離子均無干擾，滿足定量的要求。方法的精密度和準確度均能滿足藥物殘留監測需求。標準品選擇反應監測離子流色譜圖見圖2，標準品質譜圖見圖3。

表1 方法回收率和精密度測定結果

2.2 施藥濃度的選擇

水產養殖業中，外用殺蟲劑MBZ的主要水產用劑型為10% MBZ溶液，施用途徑為潑灑用藥，具體用法為2 000倍水稀釋均勻后潑灑。青魚、草魚、日本鰻鱺、鰱、鳙、鱖養殖水體每m水深用本品1 000～1 493 g/hm2[16]；歐洲鰻鱺、美洲鰻鱺養殖水體每m水深用本品2 493～4 985 g/hm2，若病情嚴重，第2 d再使用一次。青魚、草魚、日本鰻鱺、鰱、鳙、鱖養殖水體施藥濃度換算成養殖水體濃度為 10～15 μg/L；歐洲鰻鱺、美洲鰻鱺養殖水體施藥濃度換算成養殖水體濃度為 25～50 μg/L。根據實際養殖需求和條件，本實驗選擇了施藥濃度為15 μg/L(低濃度組)、50 μg/L(高濃度組)，單次潑灑，期間未換水，研究不同施藥濃度下室外養殖水體中MBZ 的消除規律。

2.3 養殖水體中MBZ實際濃度

按照1.5、1.6 方法測定養殖水體中MBZ的消除規律，結果見表2。實驗選擇了施藥濃度為15 μg/L(低濃度組)、50 μg/L(高濃度組)，但實際養殖水體中MBZ濃度分別為12.6 μg/L(低濃度組)、40.0 μg/L(高濃度組)，這與MBZ原粉在養殖水中的溶解度相關。1)MBZ溶解度隨著水溫的降低而降低。雖然實驗采用與市售產品一樣的助溶劑甲酸，但本實驗水溫較低，因此實際養殖水體中MBZ濃度低于理論值。2)養殖水體pH值也是影響MBZ溶解度的關鍵因素。當pH>8.5時，養殖水體會大量中和MBZ溶液，導致MBZ溶解性下降，從而降低MBZ的藥效。由于MBZ的助溶劑為甲酸，因此本實驗水體初始pH值約為6.8，但隨著時間的推移，水體中的甲酸逐漸揮發，水體pH值逐漸增大，至實驗結束時，pH值為7.5。該pH值范圍不會影響MBZ的溶解性。在本實驗條件下，養殖水體中MBZ實際濃度約為理論值的80%。

表2 養殖水體中 MBZ 藥物實際濃度

2.4 MBZ消除規律

光降解的效率取決于多種參數，如光的輻射強度、光照時長、藥物結構、藥物濃度等。在鋁箔保護的對照組中，MBZ濃度沒有隨著時間的推移而下降，這說明實驗期間的光解作用主要是由輻射引起的。如圖4所示，隨著時間的推移，前12 d(288 h)，室外水體中MBZ在冬季自然光照下快速下降；此后MBZ消除速率明顯變得緩慢。1)室外水體中MBZ的消除過程符合一級動力學方程Ct=C0e-kt。這與Babi’c B等[17]開展的MBZ光降解實驗結果相同，MBZ為光敏感藥物，其降解規律遵循一級動力學，也與劉永濤等[18]的長期、低濃度暴露MBZ在水體的消除實驗結果吻合。但本實驗半衰期較長 ，t1/2=(ln2)/k=0.693/k=231.05 h。這說明，低水溫(15～18℃)條件下的養殖水體中MBZ的消除速率遠低于高水溫[(25 ± 1)℃]。2)本實驗的低濃度組與高濃度組的半衰期數值基本一致，這表明藥物濃度對水體中MBZ的半衰期影響不大。3)本實驗至結束(27 d)時，低、高濃度組的自然光光降解率分別為85.9%、84.4%。相較于Babi’c B等的研究結果，本實驗總體光降解率較大，但降解速率較慢。這與Babi’ c B等采用的光源為模擬自然光的人工光照源有關，該光源可持續穩定地輸出固定光波，且光照強度大，因此短時間內的光照可使大于23.5%的MBZ發生降解；而本實驗則是模擬重現實際養殖環境，自然光的輻照強度取決于當日天氣狀況，因此輻照強度不穩定，但隨著光照時間的延長，本實驗總體光降解率較高。因此，本實驗養殖水體中MBZ消除規律可能更符合實際情況。

實驗結束(648 h)時，高濃度組養殖水體中仍有6.4 μg/L MBZ，約為青魚等養殖品種水產養殖建議用藥濃度的一半。這意味著，在實際養殖過程中，即自然光照條件下，若長時間未更換養殖水體，則其中的MBZ仍會有較多的殘留，養殖動物也仍然會通過皮膚等組織持續吸收MBZ，從而造成養殖動物各組織中MBZ及其代謝產物的殘留[19]。同樣，在未及時更換養殖水體的情況下，MBZ溶液(水產用)建議的休藥期將不適用于該水體的養殖動物。

3 結論

本研究系統地建立了高效液相色譜-串聯質譜檢測養殖水體中MBZ殘留的方法，方法靈敏度高，準確度、精密度和各項技術指標均滿足國內外殘留檢測的相關要求。同時在模擬的實際養殖條件下，以實際生產推薦使用濃度15、50 μg/L作為受試濃度，采用本文建立的檢測方法，開展室外養殖水體中MBZ的消除實驗，結果表明MBZ為光敏感藥物，其降解規律遵循一級動力學。鑒于本實驗條件下的研究結果，水溫是影響養殖水體中MBZ消除的關鍵因素，因此建議當水溫低于20℃時，應適當延長休藥期；施藥濃度也是影響養殖水體中MBZ消除的另一因素，當施藥濃度為50 μg/L時，至實驗結束(648 h)，水體中仍有6.4 μg/L MBZ，因此建議施藥7 d后，在達到藥效的情況下，盡可能地更換水體，以防止養殖動物內MBZ的殘留。由于長期暴露于MBZ下的養殖水體遵循動態消除規律，因此處于該養殖環境下的魚類體內MBZ的殘留更為復雜，需要進一步開展與魚類相關的代謝動力學研究。