龍血竭總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠Wnt/β-catenin蛋白表達的影響及其臨床意義

梁根誠 李岳勇 李昇 黃照河

【摘要】 目的 探討龍血竭總黃酮（SDF）對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）大鼠Wnt/β-catenin蛋白表達的影響及其臨床意義。

方法 將50只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為假手術（sham）組、心肌缺血再灌注模型（MIRI）組、模型+Wnt/β-catenin抑制劑（IWR-1）組、模型+龍血竭總黃酮灌胃（SDF）組、模型+Wnt/β-catenin抑制劑+龍血竭總黃酮灌胃（IWR-1+SDF）組，采用冠狀動脈前降支結扎法構建MIRI大鼠模型。TTC染色評價造模情況和SDF對模型的作用效果；蛋白質印跡法（Western blot）檢測Wnt2、β-catenin表達水平；ELISA法檢測血清血管內皮生長因子（VEGF）水平。

結果 TTC染色結果顯示動物造模成功；SDF組Wnt2相對表達量為（1.74±0.18），顯著高于sham組的（1.05±0.24）和MIRI組的（0.99±0.12），差異有統計學意義（P<0.05或0.01）。SDF組β-catenin相對表達量為（0.65±0.08），顯著低于sham組的（1.10±0.07），差異有統計學意義（P<0.01）。IWR-1組、SDF組血清VEGF含量顯著高于sham組（P<0.05）。

結論 龍血竭總黃酮可以提高MIRI大鼠Wnt2蛋白的表達水平，降低β-catenin的表達水平，對促進血管的生成有益。

【關鍵詞】 龍血竭總黃酮；心肌缺血再灌注損傷；Wnt；β-catenin；血管生成

中圖分類號：R285.5；R542.2?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.002

Effect of sanguis draconis flavones on Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury and its clinical significance

LIANG Gencheng1a，2， LI Yueyong1b， LI Sheng1a，2， HUANG Zhaohe2

（1a. Department of Emergency， 1b. Department of Tumor Intervention， 1. Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Graduate School，

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of sanguis draconis flavones （SDF） in Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） and its clinical significance.

Methods 50 male SD rats were randomly divided into 5 groups including sham group， MIRI group， model + Wnt/β-catenin inhibitor （IWR-1） group， model + sanguis draconis flavones （SDF） group， and model + IWR-1 + SDF group， with 10 rats in each group. Ligation of left anterior descending artery was used to constructed MIRI models. TTC staining was used to evaluate modeling situation and the effect of SDF on the model. Western blot was used to detect the expression levels of Wnt2 and β-catenin， and ELISA was used to detect the levels of serum vascular endothelial growth factor （VEGF）.

Results TTC staining results showed that the animal models were successfully established. The relative expression of Wnt2 in the SDF group （1.74 ± 0.18） was significantly higher than those in the sham group （1.05 ± 0.24） and the model group （0.99 ± 0.12）， and difference was statistically significant （P<0.05 or 0.01）. The relative expression of β-catenin in the SDF group （0.65 ± 0.08） was significantly lower than that in the sham group （1.10 ± 0.07）， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The serum VEGF levels in the IWR-1 group and the SDF group were significantly higher than that in the sham group （P<0.05）.

配置方法：取1.22 mL DMSO溶解5 mg IWR-1粉劑，溶解濃度為4.1 mg/mL，儲備液分裝為0.5 mL每管，儲存于-80 ℃冰箱。取0.5 mL儲備液溶解加4.5 mL玉米油稀釋，稀釋后濃度為0.41 mg/mL，放置于室溫備用，工作液于手術當天配置并使用。冠狀動脈結扎之后，關閉胸腔之前在結扎部位周圍心肌注射IWR-1工作液。IWR-1組、SDF+IWR-1組動物按照0.3 mg/kg用量計算IWR-1溶液的注射體積，其他組注射等體重體積的滅菌PBS。

1.3.3 SDF灌胃給藥

稱取SDF 1.75 g，加入PEG400∶超純水=1∶1的混合液35 mL，震蕩充分溶解，所得藥物濃度為0.05 g/mL。SDF治療組和SDF+IWR-1組的SDF給藥量為180 mg/kg，總黃酮含量按照50%計，以用量360 mg/kg計算給藥體積進行灌胃。sham組、MIRI組和IWR-1組每只大鼠按單位體重等體積灌胃PEG400∶超純水=1∶1的混合液。每天固定時間上午10：00和下午4：00對大鼠進行兩次灌胃，連續7天。

1.3.4 大鼠解剖采樣、MIRI模型檢測及藥效測評

各組大鼠在術后7天，麻醉后予頸脫臼處死，充分暴露大鼠的胸腔，心臟（心尖，避開病灶區進針）采血3 mL/只，室溫靜置30 min后，5000 r/min，10 min離心，分離血清做好標記。樣本凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.5 ELISA法檢測血管內皮生成情況

每組5個血清樣本，按照ELISA試劑盒說明書對樣品進行VEGF檢測，每個樣品重復檢測3次。

1.3.6 Western blot檢測Wnt通路相關蛋白

對每組大鼠心臟樣本取心肌梗死區，sham組取對應掛線區，加組織裂解液用組織勻漿機充分裂解，裂解的組織樣本于4 ℃，14 000 rpm離心15 min。將上清液移至干凈的EP管中待用，用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣本按照蛋白∶樣品緩沖液體積=3∶1的比例混勻，70 ℃加熱10 min變性。電泳槽中放入10% Bis-Tris預制膠及Running Buffer，每組上樣20 μL，于150 V恒壓電泳60 min。取出蛋白凝膠，PVDF膜使用甲醇激活，按負極、海綿、濾紙、蛋白凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿、正極組裝轉印模塊，于20 V恒壓轉膜90 min。取出PVDF膜，目的蛋白和內參蛋白分開剪膜。各條帶使用封閉液在搖床孵育2 h，去除封閉液，加入相應一抗在搖床中4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次15 min，加入酶標二抗在搖床中室溫孵育1 h。TBST清洗3次，每次15 min，加入ECL顯影液避光孵育5 min，使用凝膠成像系統進行拍照。每個樣品重復檢測3次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0統計軟件進行分析，計量資料采用平均數±標準差（±s）描述，多組間均數比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。用GraphPad Prism 8軟件進行蛋白質表達量柱狀圖作圖分析。

2 結? 果

2.1 MIRI大鼠模型構建

TTC染色是評價缺血損傷常用的指標，與活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲臜，表示細胞的活力。通過TTC染色發現sham組動物整個心臟TTC染色呈紅色，無梗死組織（圖1A）；MIRI組動物右心室壁有部分區域染色呈白色（圖1B）；染色結果顯示MIRI組動物符合組織梗死染色特征，表明動物模型構建成功。動物造模50只，手術當天成活43只，成活率86%。造模和灌胃7天后總體成活32只，成活率為64%。

2.2 Wnt通路蛋白Wnt2和β-catenin相對表達量

各組大鼠心肌組織Wnt2的表達量如表1和圖2所示。SDF組Wnt2相對表達量顯著高于sham組、MIRI組、IWR-1組和SDF+IWR-1組，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）。Western blot檢測各組大鼠心肌組織β-catenin的表達量如表1、圖3所示。MIRI組β-catenin相對表達量顯著低于sham組，差異有統計學意義（P<0.05）；SDF組β-catenin相對表達量顯著低于sham組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 血清VEGF含量檢測

與sham組比較，IWR-1組、SDF組、SDF+IWR-1組的血清VEGF含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）。與MIRI組比較，IWR-1組、SDF組的血清VEGF含量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討? 論

多項研究［11-13］證實龍血竭總黃酮具有很好的預防和治療心肌缺血再灌注損傷的作用，然而其作用機制報道較少。

近年來的研究闡明Wnt/β-catenin蛋白在心肌缺血再灌注損傷中發揮著重要作用，可能與其促進血管的再生、抗纖維化和抗細胞凋亡等過程有關［13］。李上海等［14］研究表明在心肌缺血再灌注損傷中β-catenin的表達下調能夠抑制MIRI的發展。

本文在成功構建了MIRI大鼠模型的基礎上，通過對照干預觀察大鼠模型療效作用。發現在MIRI組中Wnt2蛋白表達量無顯著變化，而SDF組的Wnt2表達量顯著高于sham組和MIRI組，提示SDF的作用與過表達Wnt2蛋白可能有關。Wnt2的主要功能是促進細胞增殖［15］，參與血管生成并在干細胞向血管內皮細胞分化過程中起重要作用［16］，SDF上調Wnt2的表達有利于血管內皮細胞的增殖和心肌組織修復，這對MIRI的康復至關重要。通過檢測VEGF的表達量，發現SDF組大鼠VEGF的表達量顯著升高。進一步說明SDF可能通過上調Wnt2蛋白，促進血管內皮細胞的增殖以保障心肌組織修復。

β-catenin作為轉錄因子調控下游基因的表達，主要和細胞凋亡基因的調控有關［15］。通過KEGG查找發現Wnt2和β-catenin呈負向調控關系，Wnt2表達的上調會抑制β-catenin的表達，繼而減少細胞凋亡，促進細胞增殖。本研究結果表明，SDF組Wnt2表達顯著上調時，該組β-catenin的表達顯著下降，血清VEGF的含量顯著升高，這說明SDF的作用機制之一可能是通過促進Wnt2的表達，負向調控β-catenin的表達，促進血管的生成并與緩解MIRI引起的損傷有關。

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（收稿日期：2022-12-22 修回日期：2023-03-01）

（編輯：潘明志）