miR-155在高糖誘導足細胞損傷的表達及其與足細胞損傷相關蛋白表達的相關性

王蓉 林栩 吳昱升 唐志明 王晨 韋美理 黃慕源 張潔 徐璐瑤

【摘要】 目的 探討高糖（HG）誘導足細胞損傷中miR-155的表達變化及miR-155與足細胞損傷相關蛋白表達的關系。

方法 體外培養人腎小球足細胞（AB8/13），用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激AB8/13 48 h作為HG組，同時以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細胞48 h作為正常對照（NC）組。用CCK8法檢測細胞增殖活性。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA和miR-155的表達。Western blot法檢測nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin蛋白的表達。鬼筆環肽染色觀察細胞骨架變化。細胞免疫熒光檢測蛋白nephrin、synaptopodin。

結果 HG可抑制足細胞增殖，降低細胞存活率（P<0.01）。HG作用的Ab8/13中的miR-155表達水平升高，nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA與蛋白表達水平降低（P<0.05）。HG會導致足細胞骨架紊亂。

結論 HG作用的人足細胞中miR-155表達升高，miR-155表達與HG誘導的足細胞損傷有關，可作為足細胞損傷診斷和治療的靶點。

【關鍵詞】 足細胞損傷；miR-155；高糖；足細胞相關蛋白

中圖分類號：R692.6?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.003

Expression of miR-155 in high glucose induced podocyte injury and its correlation with podocyte injury related protein expression

WANG Rong1，2， LIN Xu1，2， WU Yusheng1，2， TANG Zhiming1，2， WANG Chen1，2， WEI Meili1，2， HUANG Muyuan1，2， ZHANG Jie1，2， XU Luyao1，2

（1. Department of Nephrology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Guangxi Key Laboratory of Basic Guarantee for Medical Research of Immune-related Diseases， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the changes of expression of miR-155 in podocyte injury induced by high glucose （HG） and its relationship with podocyte injury related protein expression.

Methods Human glomerular podocytes （AB8/13） were cultured in vitro， AB8/13 stimulated with 30 mmol/L D-glucose solution for 48 h were selected as HG group， and cells treated with a final concentration of 5 mmol/L D-glucose solution for 48 h as normal control （NC） group. Cell proliferation activity was detected by CCK8. Real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect nephrin， F-actin， synaptopodin， and the mRNA and miR-155 expressions of p-cadherin. Western blot was used to detect the protein expressions of nephrin， F-actin， synaptopodin and p-cadherin. Cytoskeleton changes were observed by phalloidin staining， and cellular immunofluorescence was used to detect protein nephrin and synaptopodin.

Results HG could inhibit podocyte proliferation and decrease cell survival rate （P<0.01）. The expression level of miR-155 in Ab8/13 induced by HG increased， while the mRNA and protein expression levels of nephrin， F-actin， synaptophodin， and p-cadherin decreased （P<0.05）， and HG could cause disorder of foot cytoskeleton.

Conclusion The expression of miR-155 in human podocytes induced by HG elevates， and miR-155 expression is associated with HG induced podocyte injury， which can be served as a target for the diagnosis and treatment of podocyte injury.

【Key words】 podocyte injury;miR-155;high glucose;podocyte-associated protein

足細胞（podocyte）是腎小球的終末分化細胞，是腎小球過濾屏障形成和維持的重要組成部分，發揮通過分子電荷和大小進行選擇性過濾的功能［1］。足細胞損傷（podocyte injury）是導致蛋白尿從而促進包括糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）、狼瘡腎炎、局灶節段性腎小球硬化和膜性腎病等腎小球疾病進展的重要始發環節［2］。避免和及時修復足細胞損傷對減少DKD等疾病的發生發展有重要意義。microRNA （miRNA） 是短（20～24 nt）非編碼 RNA，通過影響 mRNA 的穩定性和翻譯，參與多細胞生物中基因表達的轉錄后調控［3］。miRNA在腎小球疾病的發生發展中發揮重要作用［4-5］。miR-155 （microRNA 155）是一種 RNA 基因，屬于 miRNA 類。miR-155能夠通過調節足細胞骨架蛋白的表達減弱DKD引起的腎損害［6-8］，miR-155與足細胞凋亡密切相關［5，9］，提示miR-155在足細胞損傷中起關鍵作用。本研究通過高糖溶液刺激人腎臟足細胞構建細胞損傷模型，從而研究高糖對足細胞損傷的影響及miR-155與高糖誘導足細胞損傷相關蛋白是否相關。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小球足細胞株AB8/13獲贈于英國Bristol大學Moin A.Saleem教授；胎牛血清（Lonsera）；RPMI 1640培養基（Gibco）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；CCK8試劑盒（日本同仁化學研究所）；4%多聚甲醛（absin）；TrixonX-100（absin）；CoraLite？倕

488標記鬼筆環肽（proteintech）；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）（Solarbio）；ＲIPA 蛋白裂解液（Solarbio）；5x蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）（Solarbio）;（SDS-PAGE電泳液（碧云天）；western轉膜液（碧云天）；三色預染蛋白Marker（Affinity）；雙敏化學發光試劑（ECL Reagent）（Affinity）； Anti-nephrin antibody、Anti-F-actin antibody（abcam）；GAPDH Ab（Affinity）； HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（proteintech）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green Qpcr Mix（Monad）；nephrin、p-cadherin、synaptopodin、GAPDH、F-actin、U6 PCR引物合成（武漢金開瑞生物工程有限公司），miR-155 PCR引物合成（上海生工生物工程股份有限公司），引物序列見表1。多功能酶標儀（Thermo）；電泳儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統（Tanon）；激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 足細胞的培養及分組處理

體外培養AB8/13足細胞，足細胞復蘇后用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養基在37 ℃、5%CO2培養箱條件下培養，每隔2～3 d 換液或傳代一次，取對數生長期細胞在不含血清的培養基條件下饑餓培養12 h后用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培養細胞48 h作為高糖（HG）組，同時以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細胞作為正常對照（NC） 組［10］。

1.2.2 CCK8法檢測細胞增殖

設置As：實驗孔（含有細胞、30 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ac：對照孔（含細胞、5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ab：空白孔（含5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液，不含細胞和CCK8溶液）。將各組細胞按5×103個/孔接種于96孔板，每孔的最終體積為100 μL，每組設5個復孔，培養24 h，待細胞貼壁后，更換為無血清培養基饑餓培養12 h，向培養板內各組加入相應的培養液，在培養箱中培養48 h后，在As、Ac組中的每孔內加入10 μL的CCK8溶液，將培養板放培養箱內培養3 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（OD）。細胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。

1.2.3 qRT-PCR檢測nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA及miR-155表達水平

用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，用超微量紫外分光光度計測定OD260/280及RNA濃度。使用Monad逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。按照Monad熒光定量PCR試劑盒使用說明配置反應體系，使用LightCycler？倕

96 實時熒光定量PCR儀進行檢測。檢測nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin、GAPDH、miR-155、U6的mRNA表達。每個樣品重復實驗3次，PCR的反應程序：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，擴增45個循環，72 ℃延伸10 min。相對表達量采用2-△△Ct法來進行數據分析。

1.2.4 Western blot檢測nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白表達

加入適量的RIPA裂解液充分裂解各組細胞，4 ℃，12 000 g離心10 min，收集蛋白上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100 ℃煮10 min變性。吸取30～50 μg蛋白經電泳分離后轉膜至0.45 μm PVDF膜，用含5% BSA的TBST 搖床封閉1 h，1xTBST清洗3次，每次5 min，分別加入一抗稀釋液稀釋的nephrin（1∶1000）、F-actin（1∶1000）、p-cadherin（1∶1000）、synaptopodin（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000）抗體，4 ℃搖床搖晃孵育過夜，第2天TBST洗膜3次，每次3 min后加入相應的抗兔IgG-HRP（1∶5000），室溫搖床孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入現配置的ECL 發光液，凝膠化學發光成像儀曝光，利用Image J 軟件進行蛋白條帶分析，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復實驗3次。

1.2.5 鬼筆環肽染色觀察細胞骨架變化

將各組細胞按2×103的密度接種于共聚焦培養皿內，每個皿內的最終體積為500 μL，移入培養箱內培養，6 h后待細胞貼壁后，每個皿內加入完全培養基至2 mL繼續培養、處理，按實驗分組干預足細胞，至干預時間點后，吸棄舊培養液，用PBS清洗細胞3次，加入4%多聚甲醛溶液冰上固定細胞15 min，用PBS清洗細胞3次，用含0.2%Triton X-100的PBS溶液室溫透化細胞5 min，用PBS清洗細胞3次，分別加入200 μL 熒光標記的鬼筆環肽儲液（稀釋比例為1∶100），室溫避光孵育20 min進行染色，用PBS清洗細胞3次，每個皿內分別滴加50 μL的抗熒光衰減封片劑（含DAPI），激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測

按實驗分組干預足細胞，干預到時間點后，用PBS清洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛溶液冰上固定15 min，用PBS清洗3次，再加入PBS 溶液稀釋的0.2% Triton X-100，室溫孵育5 min 后，PBS清洗3次，向各孔中加入適量的5%正常山羊血清，常溫孵育1 h，吸水紙吸掉封閉山羊血清，PBST清洗3次，加入抗體稀釋液稀釋的nephrin（1∶500）、F-actin（1∶500），4 ℃孵育過夜，次日將一抗棄掉，PBST清洗3次，滴加稀釋好的熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBST清洗3次，往各孔中滴加抗熒光衰減封片劑（含DAPI），在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3 統計學方法

運用SPSS 26.0統計軟件分析數據。所有數據均進行正態分布和方差齊性檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結? 果

2.1 觀察細胞的形態學特征

在37 ℃，5%CO2條件下培養細胞，使用相差顯微鏡觀察細胞，發現細胞周邊有足突，細胞與細胞之間有足突間隙連接，一些細胞呈“樹枝狀”。見圖1。

2.2 nephrin、synaptopodin在實驗細胞中的表達

免疫熒光法檢測腎小球足細胞的特異性蛋白nephrin、synaptopodin，實驗結果表明，實驗過程中用的細胞熒光染色明顯，表達nephrin、synaptopodin蛋白。見圖2。nephrin蛋白是足細胞特異性蛋白，主要表達在細胞的胞膜、細胞質和核周。synaptopodin蛋白是反映足細胞分化成熟的特異性蛋白。所以，實驗用的細胞的形態學特征符合人腎小球足細胞，且表達足細胞特異性nephrin、synaptopodin蛋白，因此，本實驗用的細胞是人腎小球足細胞，可用于后續的試驗。

2.3 HG干預對體外培養的人腎小球足細胞增殖活性的影響

30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足細胞，干預時間為48 h，與正常對照組相比較，細胞增殖活性受到抑制，細胞活性降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖3。

2.4 HG誘導足細胞損傷對miR-155表達的影響

正常對照組中miR-155的表達量較低，使用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足細胞48 h，miR-155表達上調，差異有統計學意義（P<0.01） 。見表2。

2.5 HG誘導足細胞損傷對nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin mRNA 表達的影響

與正常對照組相比，HG干預足細胞48 h后，nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin 的mRNA表達均明顯下調。見表2。

2.6 HG誘導足細胞損傷對nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白的影響

Western blot 結果顯示，HG干預足細胞48 h后，HG組nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白與NC組相比較均明顯降低（P<0.05）。見圖4。

2.7 高糖誘導足細胞損傷細胞骨架變化

激光共聚焦顯微鏡觀察足細胞骨架顯示：NC組足細胞骨架排列有序，結構清晰，沿細胞長軸呈放射狀分布，足突明顯，熒光強度明亮，而HG組足細胞形態發生改變，變圓鈍、皺縮，骨架結構斷裂，排列紊亂，足突減少，與NC組相比較，熒光強度表達明顯暗淡。見圖5。

2.8 細胞免疫熒光檢測nephrin、synaptopodin蛋白

結果顯示，足細胞nephrin蛋白主要在胞膜、細胞質及核周表達，呈顆粒或線狀分布，HG組nephrin蛋白熒光與NC組相比較，表達量減少，nephrin蛋白熒光減弱，蛋白表達趨勢與Western blot、qRT-PCR結果一致。synaptopodin只在分化成熟的足細胞中表達，主要分布在胞漿、周邊、次級突起，HG處理后的足細胞synaptopodin蛋白熒光減弱，部分向核周分布。synaptopodin蛋白的表達與Western blot、qRT-PCR結果一致。見圖6。

3 討? 論

DKD被認為是糖尿病的主要微血管并發癥，是導致終末期腎病的主要原因［11］。盡管近年來關于DKD的研究已取得很大進展，但其分子水平的具體發病機制尚未明確。足細胞是終末分化的腎小球內臟上皮細胞，是腎小球濾過屏障的重要組成部分。腎小球足細胞損傷是腎小球功能障礙的核心事件，可導致糖尿病介導的蛋白尿和腎臟疾病［12］。在臨床實踐中發現糖尿病患者早期會有足細胞丟失和足細胞完整性受損［13］。足細胞在DKD中經歷了一系列形態和功能變化，包括肥大、上皮-間質轉化、分化、脫落和凋亡［14］。足細胞損傷伴隨著細胞活力、炎癥、纖維化的降低和足細胞功能障礙的增加［15］，高血糖會誘導培養的足細胞凋亡并減少足細胞數量，加速足突消失和尿白蛋白排泄［16］。另外，高血糖和血管緊張素Ⅱ引起的足細胞損傷，如氧化應激、足細胞死亡和線粒體功能障礙，已被證實與 DKD 中的 GFB 破壞和蛋白尿密切相關［17］。因此，腎小球足細胞損傷被認為是導致DKD的主要機制之一。然而，控制足細胞損傷的相關機制尚不清楚。因此，足細胞損傷相關機制的研究可為DKD發病機制的研究提供思路。

miRNA在人類細胞和組織中廣泛表達，參與了細胞增殖凋亡、人體病理生理以及疾病發展預后等過程。miR-155在多個層面參與生物控制，通過靶mRNA 的翻譯抑制或不穩定來調節對細胞發育和功能至關重要的基因表達［2］。已發現 miR-155 在幾種活化的免疫細胞中明顯上調，包括 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）。在先天免疫反應過程中，它被廣泛的炎癥介質上調［5］。據報道，miR-155在某些細胞和動物模型中抑制葡萄糖代謝［18］，由 miR-155調節影響葡萄糖和脂質代謝的靶基因仍然未知。因此，深入研究miR-155調控糖尿病腎病的分子機制有利于進一步闡明DKD足細胞損傷的發病機制。

nephrin 是一種重要的裂隙隔膜蛋白［19-20］，可協調足細胞中細胞連接和細胞骨架動力學之間的相互作用。其他裂孔隔膜蛋白p-cadherin和synaptopodin對穩定足細胞的正常生理功能具有重要作用［20］。足細胞有著復雜的肌動蛋白細胞骨架結構，肌動蛋白F-actin嚴格控制足突的形成過程［21］，因此，細胞骨架結構的穩定性與足細胞的損傷密切相關。本研究證實高糖誘導足細胞損傷模型中，足細胞的增殖活性受到抑制，足細胞相關蛋白因子nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA和蛋白表達減少，細胞骨架結構回縮、斷裂，排列紊亂，最終導致足細胞足突融合、消失等。

本研究證實，在高糖誘導的足細胞損傷模型中，miR-155表達上調，表明miR-155參與高糖誘導的足細胞損傷過程，為DKD的防治提供了新的思路，但 miR-155 在高血糖誘發的腎病中的作用仍不清楚，其具體作用機制仍需進一步開展深入研究。

參 考 文 獻

［1］ ?DOS SANTOS M，POLETTI P T，MILHORANSA P，et al. Unraveling the podocyte injury in lupus nephritis： clinical and experimental approaches［J］. Semin Arthritis Rheum，2017，46（5）：632-641.

［2］ ?ASANUMA K. The role of podocyte injury in chronic kidney disease［J］. Jpn J Clin Immunol， 2015， 38（1）：26-36.

［3］ ?MOHR A M， MOTT J L. Overview of microRNA biology［J］. Semin Liver Dis， 2015， 35（1）：3-11.

［4］ ?FU J， LEE K， CHUANG P Y， et al. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2015， 308（4）：F287-F297.

［5］ ?LIN X， YOU Y W， WANG J， et al. MicroRNA-155 deficiency promotes nephrin acetylation and attenuates renal damage in hyperglycemia-induced nephropathy［J］. Inflammation， 2015， 38（2）：546-554.

［6］ ?KANG J S， LEE S J， LEE J H， et al. Angiotensin Ⅱ-mediated MYH9 downregulation causes structural and functional podocyte injury in diabetic kidney disease［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）：7679.

［7］ ?TIAN X F， ISHIBE S. Targeting the podocyte cytoskeleton：from pathogenesis to therapy in proteinuric kidney disease［J］. Nephrol Dial Transplant， 2016， 31（10）：1577-1583.

［8］ ?FUJITA Y， TOMINAGA T， ABE H， et al. An adjustment in BMP4 function represents a treatment for diabetic nephropathy and podocyte injury［J］. Sci Rep， 2018， 8（1）：13011.

［9］ ?古賢君，林栩，凌霄雁，等.miR-155調控線粒體自噬對足細胞損傷的機制研究［J］. 右江醫學，2020，48（5）：326-333.

［10］ ?祁月，張葉，郭乃鳳，等.Klotho蛋白通過抑制β-catenin減輕高糖誘導的足細胞損傷［J］. 交通醫學，2021，35（1）：17-20.

［11］ ?ZHENG W， GUO J， LIU Z S. Effects of metabolic memory on inflammation and fibrosis associated with diabetic kidney disease：an epigenetic perspective［J］. Clin Epigenetics， 2021， 13（1）：87.

［12］ ?FAN X B， HAO Z M， LI Z J， et al. Inhibition of miR-17～92 cluster ameliorates high glucose-induced podocyte damage［J］. Mediators Inflamm， 2020， 2020：6126490.

［13］ ?DIEZ-SAMPEDRO A， LENZ O， FORNONI A. Podocytopathy in diabetes：a metabolic and endocrine disorder［J］. Am J Kidney Dis， 2011， 58（4）：637-646.

［14］ ?ZHANG Q J， HU Y C， HU J E， et al. Sp1-mediated upregulation of Prdx6 expression prevents podocyte injury in diabetic nephropathy via mitigation of oxidative stress and ferroptosis［J］. Life Sci， 2021， 278：119529.

［15］ ?ZHANG Y Y， XU C X， YE Q， et al. Podocyte apoptosis in diabetic nephropathy by BASP1 activation of the p53 pathway via WT1［J］. Acta Physiol （Oxf）， 2021， 232（1）：e13634.

［16］ ?BARUTTA F， KIMURA S， HASE K， et al. Protective role of the M-sec-tunneling nanotube system in podocytes［J］. J Am Soc Nephrol， 2021， 32（5）：1114-1130.

［17］ ?LIN C L， HSU Y C， HUANG Y T， et al. A KDM6A-KLF10 reinforcing feedback mechanism aggravates diabetic podocyte dysfunction［J］. EMBO Mol Med， 2019， 11（5）：e9828.

［18］ ?ZHU J J， WANG C Z， ZHANG X T， et al. Correlation analysis of microribonucleic acid-155 and microribonucleic acid-29 with type 2 diabetes mellitus， and the prediction and verification of target genes［J］. J Diabetes Investig， 2021， 12（2）：165-175.

［19］ ?TSUJI K， PUNESCU T G， SULEIMAN H， et al. Re-characterization of the glomerulopathy in CD2AP deficient mice by high-resolution helium ion scanning microscopy［J］. Sci Rep， 2017， 7（1）：8321.

［20］ ?KURIHARA H， ANDERSON J M， KERJASCHKI D， et al. The altered glomerular filtration slits seen in puromycin aminonucleoside nephrosis and protamine sulfate-treated rats contain the tight junction protein ZO-1［J］. Am J Pathol， 1992， 141（4）：805-816.

［21］ ?凌霄雁.MiR-155通過整合a3β1/FAK/RhoA/ROCK骨架通路調控TGF-β1誘導足細胞損傷的分子機制研究［D］.百色：右江民族醫學院， 2020.

（收稿日期：2022-08-12 修回日期：2022-10-08）

（編輯：梁明佩）