基于IGF-1R/PI3K/AKT的益氣固表丸對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影響及作用機制研究

徐丹　荊晶　李爭　王晶　姜敏　王益德　張艷麗

摘要 目的：益氣固表丸對慢性阻塞性肺疾病（COPD）有明顯的治療作用，但具體作用機制尚不清楚。本研究旨在探討益氣固表丸對脂多糖（LPS）聯合煙霧暴露構建慢性阻塞性肺病模型大鼠的治療作用機制。方法：通過大鼠氣管內灌注LPS和吸入香煙煙霧構建慢性阻塞性肺病模型，同時給予模型大鼠低、中、高劑量益氣固表丸治療14 d。觀察呼吸參數及肺組織病理變化。采用酶聯免疫吸附試驗測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）及血清胰島素樣生長因子1型受體（IGF-1R）、白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-10水平。采用蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織樣品中胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）/PI3K/AKT信號通路組分的磷酸化狀態。結果：與對照組和低劑量益氣組比較，大劑量益氣固表丸治療可顯著改善COPD大鼠呼吸參數，減輕肺損傷和炎癥，降低BALF和血清炎癥介質水平。此外，高劑量益氣固表丸干預的COPD大鼠肺組織標本中磷酸化IGF-1R、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3、p-mTOR蛋白水平顯著降低。結論：益氣固表丸對COPD有明顯的治療作用，可能與靶向IGF-1R/PI3K/AKT信號通路有關。

關鍵詞 益氣固表丸；脂多糖；慢性阻塞性肺疾病；IGF-1R/PI3K/AKT信號通路；作用機制；胰島素樣生長因子1受體；白細胞介素-1β；白細胞介素-10

Effects and Mechanism of Yiqi Gubiao Pills on Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Model Rats Based on IGF-1R/PI3K/AKT Signaling Pathway

XU Dan1，2，3，JING Jing1，2，3，LI Zheng1，2，3，WANG Jing1，2，JIANG Min1，2，WANG Yide1，2，3，ZHANG Yanli3

（1 National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine，Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830090，China; 2 Xinjiang Key Laboratory Respiratory Disease Research，Urumqi 830090，China; 3 Respiratory Department，Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830090，China）

Abstract Objective：Yiqi Gubiao Pills have a definite therapeutic effect on chronic obstructive pulmonary disease（COPD），but the specific mechanism of action remains unclear.This study aimed to explore the therapeutic mechanism of Yiqi Gubiao Pills in the treatment of COPD in rats induced by lipopolysaccharide（LPS） combined with cigarette smoke exposure.Methods：The COPD model was induced in rats by intratracheal instillation of LPS and cigarette smoke inhalation.Meanwhile，the model rats were treated with low-，medium-，or high-dose Yiqi Gubiao Pills for 14 days.The respiratory parameters and pulmonary histopathological changes were examined.The enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was conducted to measure the levels of insulin-like growth factor 1 receptor（IGF-1R），interleukin（IL）-1β，and IL-10 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） and serum.Western blot was used to determine the phosphorylation of the components in the IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway in the lung tissues of rats.Results：Compared with the control group and the low-dose Yiqi Gubiao Pills group，the high-dose Yiqi Gubiao Pills group showed significantly improved respiratory parameters，alleviated lung injury and inflammation，and reduced proinflammatory cytokine levels in BALF and serum of COPD rats.Furthermore，high-dose Yiqi Gubiao Pills could significantly reduce the protein levels of phosphorylated（p）-IGF-1R，p-PI3K，p-AKT，p-GSK3，and p-mTOR in the lung tissues of COPD rats.Conclusion：Yiqi Gubiao Pills have a definite therapeutic effect on COPD，and the mechanism may be related to targeting the IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway.

Keywords Yiqi Gubiao Pills; Lipopolysaccharide; Chronic obstructive pulmonary disease; IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway；Mechanism of action；Insulin-like growth factor 1 receptor；Interleukin-1β；Interleukin-10

中圖分類號：R256.14文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.014

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種進行性和部分可逆的慢性肺部疾病，其特征是有毒顆粒或氣體對氣道和肺誘導的慢性炎癥反應導致氣流阻塞［1］，吸煙是COPD的主要危險因素［2］，患病率為8.80%～14.53%［3］，全球每年有200多萬人死于COPD［4］。據預測到2030年COPD將上升到全球第3大死亡原因［5］。因此，制定有效的方法來預防COPD的發展是非常重要的。

近年來研究人員發現，中醫實踐中常用的益氣固表丸可以改善COPD大鼠肺功能，緩解肺部炎癥［6］。臨床隨機、雙盲實驗研究表明益氣固表丸可改善穩定期COPD患者的喘息、咳嗽、咳痰等癥狀［7-8］。益氣固表丸的主要中藥黨參、白術、黃芩等已被證明具有體內外免疫調節和抗炎作用［9-11］；黃芩治療COPD大鼠可減輕氣道重塑［11］。然而，益氣固表丸治療COPD療效的確切機制尚不清楚。

胰島素樣生長因子1受體（Insulin-like Growth Factor Type1 Receptor，IGF-1R）是一種通過IGF1和IGF2結合激活的跨膜酪氨酸激酶，在肺癌、炎癥、纖維化等肺部發育和疾病中發揮重要作用［12］。IGF1結合IGF-1R激活參與COPD發病機制的磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信號通路［13］。COPD中存在IGF1/IGF-1R信號通路表達異常［12］。研究表明，PI3K信號通路在COPD中被激活導致包括AKT、糖原合成酶激酶3（Glycogen Synthase Kinase-3，GSK3）和mTOR等下游介質磷酸化水平升高［14-15］，PI3K亞型因此成為COPD潛在治療靶點［16］。PI3Kδ抑制劑GSK2269557的臨床試驗在COPD患者中取得了良好的治療效益和安全性［17-18］。因此，我們推測益氣固表丸可能通過靶向IGF-1R/PI3K/AKT信號通路來改善COPD癥狀。

為了驗證這一假設，我們前期已經采用網絡藥理學方法確定益氣固表丸治療COPD潛在治療靶點和機制［19-21］，本研究進一步評估益氣固表丸對脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）聯合吸煙誘導的COPD模型大鼠經肺損傷和炎癥的治療作用，結果提示益氣固表丸可通過阻斷IGF-1R/PI3K/AKT信號通路減輕COPD肺損傷和炎癥反應，為益氣固表丸治療COPD的作用機制研究提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠75只，8周齡，體質量（200±50）g。購自新疆醫科大學動物中心，生產許可證號：SYCK（新）2018-0002，使用許可證號：SYSK（新）2018-0003。所有動物護理和實驗程序均由新疆醫科大學倫理委員會批準（倫理審批號：IACUC-201905301-37）。所有動物實驗均按照《新疆醫科大學動物實驗正確實施指南》進行。

1.1.2 藥物 益氣固表丸購自新疆醫科大學附屬中醫院中心藥房。

1.1.3 試劑與儀器 ELISA試劑盒（聯科生物，批號：70-EK301B/3-96，70-EK310/2-96），RIPA（放射免疫沉淀法）緩沖液（Boster生物技術，批號：AR0105）；IGF抗體（Abcam，英國，批號：ab182408），IGF-1R（武漢華美，批號：CSB-E13873r）PI3抗體（Abcam，英國，批號：ab191606），AKT 1/2/3抗體（Abcam，英國，批號：ab179463），Anti-GSK3 Beta+GSK3 Alpha抗體（Abcam，英國，批號：ab185141），mTOR抗體（Abcam，英國，批號：ab32028）；倒置顯微鏡（尼康，日本，型號：E200），小動物肺功能全身容積描記儀（Buxco，英國，型號：WBP），酶標儀（Bio-Rad，美國，型號：xMarkTM），化學發光成像儀系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：Chemiscope 3000），蛋白轉膜（Bio-Rad，英國，型號：Mini-PROTEAN Tetra system）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將大鼠隨機分為對照組、慢阻肺組、慢阻肺+益氣固表低劑量組、慢阻肺+益氣固表中劑量組、慢阻肺+益氣固表高劑量組，每組15只。采用吸入煙霧、氣管內灌注LPS的方法建立大鼠COPD模型［22-23］。大鼠在煙草煙霧室中暴露于香煙煙霧（12 mg焦油，1.1 mg尼古丁和14 mg一氧化碳）1 h，2次/d，4 h無煙間隔/次，持續90 d。對照組大鼠暴露于室內空氣中，在第30天進行氣管內灌注LPS。大鼠經腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉，氣管內灌注LPS 100 μL（2 mg/mL）。對照組大鼠給予等量0.9%生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 從第1天開始，用含0.66 g/kg（低劑量）、1.31 g/kg（中劑量）、2.62 g/kg（高劑量）益氣固表丸的水溶液10 mL/kg灌胃給大鼠，1次/d，連續14 d。根據美國食品藥品監督管理局建議的公式：人當量劑量=大鼠劑量×0.16，中劑量可與臨床應用的人相當；對照組和COPD組大鼠給予等量蒸餾水。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 呼吸參數測量 益氣固表丸治療14 d后，采用全身容積描記儀測定呼吸頻率（Respiratory Frequency，f）、潮氣量（Tidal Volume，TVb）、每分鐘通氣量（Minute Ventilation Volume，MVb）、吸氣峰流量（Peak Inspiratory Flow，PIFb）、呼氣流量峰值（Peak Expiratory Flow，PEFb）、吸氣時間（Inspiratory Time，Ti）、呼氣時間（Expiratory Time，Te）和50%潮氣量呼氣流量（Tidal Expiratory Flow at 50% of Tidal Volume，TEF50）等呼吸參數。

1.3.2 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法觀察病理學改變 所有大鼠于第90天處死。采集肺組織樣本，用4%多聚甲醛固定，制備4 μm厚的組織切片，并進行HE染色。采用倒置顯微鏡觀察肺泡壁增厚、中性粒細胞浸潤等組織病理學改變。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗 經37 ℃，2次灌注生理鹽水30 mL，于4 ℃，3 000×g離心15 min，第90天收集支氣管肺泡灌洗液。收集上清，-80 ℃保存。根據生產商的說明書，使用ELISA試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中IGF-1R、白細胞介素（Interleukin，IL）-1β和IL-10濃度。

1.3.4 蛋白質印跡法（Westen Blooting）分析 大鼠肺組織標本于第90天采集，用RIPA緩沖液在冰上均質，然后離心半徑15 cm，12 000 r/min離心15 min。使用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后用抗IGF-1R的一抗（1∶500；ab182408），p-IGF-1R（1∶500；ab39398），PI3K（1∶1 000；ab191606），p-PI3K（1∶2 000；ab182651），一種蛋白激酶（1∶800；ab179463），p-AKT（1∶800；ab192623），人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（Phosphatase and Tensin Homologue Deleted on Chromosome Ten，PTEN）；（1∶2 000；GSK3 ab32199），（1∶1 000；ab185141），p-GSK3（1∶800；ab68476），mTOR（1∶800；ab32028），p-mTOR（1∶800；ab137133），或β肌動蛋白（1∶800）在4 ℃過夜，然后用含0.1% Tween 20（TBST）的tris緩沖鹽水洗3次。然后用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶500；ab205718；Abcam）在室溫下保存1 h。再用洗滌緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗3次后，使用Chemiscope 3000對蛋白條帶進行可視化和分析。

1.4 統計學方法 采用Prism 6.0統計軟件（Graphpad，San Diego，CA，USA）進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用t檢驗或方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 益氣固表丸對COPD大鼠呼吸參數的影響 與對照組比較，LPS+香煙煙霧暴露導致大鼠呼吸頻率顯著增加，TVb、MVb、PIFb、PEFb、Ti、Te、EF50顯著降低，說明COPD大鼠模型建立成功。益氣固表丸治療COPD組大鼠呼吸頻率降低，其他參數升高，且呈劑量依賴性，提示益氣固表方可改善COPD大鼠呼吸功能。見表1。

2.2 大劑量益氣固表丸對COPD大鼠肺組織病理學的影響 觀察益氣固表丸對COPD肺損傷的作用。肺組織標本HE檢查顯示，與對照組比較，COPD大鼠表現出明顯的結構改變和炎癥反應，包括肺泡損傷、支氣管上皮損傷、炎癥細胞浸潤。與對照組、低、中劑量益氣固表丸治療比較，高劑量益氣固表丸治療可預防COPD大鼠肺組織肺泡、支氣管上皮破裂及淋巴細胞和炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.3 大劑量益氣固表丸可調節COPD大鼠BALF及血清細胞因子水平 高劑量益氣固表丸顯著降低COPD大鼠BALF和血清中IL-1β水平，升高IL-10水平。BALF和血清IGF-1R水平無明顯變化。見表2～3。

2.4 大劑量益氣固表丸抑制COPD大鼠IGF-1R/PI3K/AKT信號通路 與對照組比較，COPD大鼠肺組織標本中p-IGF-1R、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3蛋白水平顯著升高，PTEN、p-mTOR蛋白水平顯著降低。與對照治療比較，益氣固表丸高劑量治療可有效阻斷COPD大鼠IGF-1R/PI3K/AKT信號通路的激活。見圖2A～G。

3 討論

前期研究通過整合中醫研究中廣泛使用的網絡藥理學數據庫和工具［24］，我們發現益氣固表丸在COPD治療中可能與調控PI3K/AKT信號通路有關。本研究結果顯示，與對照組、益氣固表丸低、中劑量組比較，高劑量益氣固表丸治療可有效預防LPS聯合煙霧暴露誘導的COPD大鼠的疾病進展，

改善呼吸參數，減輕肺組織病理異常，抑制COPD大鼠BALF和血清細胞因子水平。此外，高劑量益氣固表丸治療COPD大鼠可阻斷IGF-1R/PI3K/AKT信號通路的激活進而抑制COPD的疾病發展。

COPD小鼠模型常采用吸入香煙煙霧加氣管內注射LPS進行誘導［23］。本研究結果表明，與對照組比較，COPD大鼠出現了明顯的呼吸功能受損，COPD組出現了典型的肺組織病理學改變，細胞因子分泌失調，說明COPD大鼠模型建立成功。我們進一步發現，以2.62 g/kg益氣固表丸湯治療14 d，可有效防止大鼠COPD疾病進展。與JIANG等［6］研究一致，2.36 g/kg益氣固表丸可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的咳嗽潛伏期和頻率、呼吸阻力以及氣管黏膜和肺的組織病理學改變。提示益氣固表丸是一種有前景的治療COPD藥物。

COPD與肺和全身炎癥反應密切相關，以血液炎癥介質水平升高為特征，在晚期中更為明顯［25］。IL-1β是一種典型的炎癥介質，在COPD中啟動和維持氣道炎癥起關鍵作用［26］。COPD急性加重患者中血清IL-1β水平明顯高于穩定期患者或健康對照組，且與血清C反應蛋白和IL-17水平正相關，可作為持續氣道炎癥和COPD持續加重的指標［27］。另一方面，IL-10被認為是COPD中的一種抗炎細胞因子。ZHANG等［28］研究證明，與健康的非吸煙對照組比較，健康吸煙者和COPD患者血清和痰中IL-10水平均顯著降低。最近的一項研究報道，血清IL-10水平低與COPD患者呼吸參數惡化相關［29］。SILVA等［30］發現COPD患者的病情嚴重程度與血清IL-10水平負相關。在COPD中，BALF和血清細胞因子水平的變化反映肺部和全身炎癥水平［31］。因此，我們試圖確定益氣固表丸是否能影響COPD患者BALF及血清細胞因子水平。與上述結果一致，本研究數據顯示，與對照組比較COPD大鼠BALF和血清中IL-1β水平顯著升高，IL-10水平降低，高劑量益氣固表丸治療可有效逆轉這一現象。結合HE染色結果，提示大劑量益氣固表丸可緩解COPD患者的肺部和全身炎癥反應。

前期生物信息學分析結果提示益氣固表丸在COPD治療中可能靶向PI3K/AKT信號通路。考慮到IGF-1R信號主要激活PI3K/AKT下游信號通路，我們假設益氣固表丸方可能在COPD治療中調節IGF-1R/PI3K/AKT信號通路。有報道稱IGF-1R/AKT/mTOR信號通路的激活通過抑制受損細胞成分的自噬消除而參與COPD的發病［32］。消耗IGF-1R可保護小鼠免受氧誘導的肺損傷［33］。消蝕IGF1-IGF1R軸可抑制巨噬細胞中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization domain-like Receptor Protein 3，NLRP3）炎癥小體，提示IGF-1R對肺炎癥的啟動至關重要［34］。為了研究IGF-1R/PI3K/AKT信號通路在益氣固表丸治療COPD中的作用，我們檢測了大鼠肺組織樣本中該通路成分的磷酸化狀態。在本研究中，益氣固表丸治療COPD大鼠并未影響BALF和血清IGF-1R水平，可能是因為IGF-1R不是分泌蛋白，而大劑量益氣固表丸治療后COPD大鼠肺組織標本中IGF-1R及下游效應因子磷酸化水平顯著升高。相反，PI3K的負調控因子PTEN的蛋白表達在高劑量益氣固表丸治療后顯著上調［35］。以上數據提示，大劑量益氣固表丸可通過抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路抑制COPD的發展。

綜上所述，在本研究中提示PI3K/AKT通路是益氣固表丸治療COPD的潛在治療靶點。高劑量益氣固表丸（2.62 g/kg）通過抑制IGF1R/PI3K/AKT信號通路可減輕COPD大鼠肺損傷和炎癥，本研究為益氣固表丸治療COPD的作用機制研究提供了新思路。

利益沖突聲明：無。

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（2021-08-26收稿 本文編輯：吳珊）

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2018D01C282）作者簡介：徐丹（1983.01—），女，碩士，副主任醫師，研究方向：中西醫結合呼吸病學，E-mail：66601443@qq.com通信作者：張艷麗（1985.04—），女，博士，副主任醫師，研究方向：中西醫結合呼吸病學，E-mail：171179265@qq.com