獸用滅活疫苗的研究進展

洛桑江白

（西藏自治區獸醫生物藥品制造廠 拉薩 850000）

從18 世紀后期發現接種牛痘可以讓人類免受天花感染開始，疫苗在人類和動物的生命健康發揮了關鍵作用。疫苗接種是預防傳染病最具成本效益的干預策略之一，是防止各種傳染病傳播的最有效、最經濟的手段[1]。

疫苗根據制備程序及疫苗研發的進度，可以大致分為：常規疫苗如弱毒疫苗（活疫苗）、滅活疫苗、類毒素疫苗；基因工程疫苗如亞單位疫苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗，以及目前仍處于實驗室研究階段的轉基因植物可食用疫苗和抗獨特型疫苗等。而滅活疫苗制備具有研發耗時短、工藝相對統一、簡單，免疫過程中無感染毒力、使用安全等優點，已經在多種傳染病的預防上發揮了很好干預作用[2]。但是滅活疫苗可能會出現病毒抗原的損害，降低疫苗免疫活性及維持時間短等弊端需要進一步優化工藝流程，選用引發更持久性的免疫反應的佐劑和增加發酵的活菌數及增強疫苗免疫力的培養基，研制多聯滅活疫苗，減少單苗多次免疫造成的應激反應等途徑，研制出免疫持續時間長，免疫保護范圍廣的滅活疫苗，創造更多的經濟價值具有重大意義。

1 優化工藝流程

以重組禽流感滅活疫苗為例，基于甲醛進行疫苗滅活時，病毒株蛋白中存在核酸物質，對甲醛反應較為靈敏，與甲醛滅活試劑結合容易造成病毒體中的蛋白質凝結，造成很多游離甲醛的存在，由于禽流感病毒具有生物特性，蛋白質就是主要結構物質，一旦病毒株蛋白質發生凝結，疫苗作用將大大降低[3]。在使用甲醛試劑完成病毒原液處理后，病毒株已經具備了滅活性。因此，可以增加離心工藝處理環節，解決病毒株蛋白質的破壞。通過離心儀器設備，將原液作為處理對象，對已經完成基本滅活的病毒抗原原液進行離心。應至少保證對同一原液離心2 次，確保離心處理徹底[3]。在離心操作后用生物膜技術實施過濾，病毒抗原原液提純完成后，再次使用甲醛試劑來進行二次滅活。

崔松奇等[4]從狂犬病凍干滅活疫苗的下游工藝規模化生產試驗得知，上樣量多少與洗脫流速對凝膠過濾純化有一定的影響。加樣量多了，影響分離效果；加樣量少了，生產效率低。經試驗，當加樣量為5%～8%柱床體積時，雜蛋白峰與病毒峰可以完全分開，雜蛋白去除率93%以上。洗脫速度也是柱層析獲得良好分離的重要條件。一般來講，洗脫流速慢一點，樣品與凝膠基質充分平衡，分離效果更好，但洗脫流度太慢會造成樣品擴散，區帶變寬，降低分辨率，且生產時間會延長。而隨著洗脫流速的越來越大，無論是抗原回收率還是雜蛋白去除率效果均不佳。因此，實驗中應該根據實際情況來選擇適合的洗脫流速。純化時加樣量為8%柱床體積，洗脫流速為30～40 cm/h 的線性流速，通過驗證可以滿足規模化生產。

2 選用優良的佐劑

疫苗組分中的佐劑具有抗原儲存庫效應，從而輔助增強免疫反應。鋁膠佐劑是較為常用的疫苗佐劑之一，常規鋁膠佐劑偶有注射部位紅疹、皮下結節、接觸性過敏等不良反應。寇亞楠等[5]研究發現將鋁膠佐劑納米化后，包裹或表面結合抗原的納米粒子，能使蛋白抗原的表面充分暴露，鋁膠佐劑的表面積會增加，吸附能力更強。因此提高抗原的靶向投遞，降低不良反應。抗原結構變的更穩定，促進淋巴結的攝取，能引起強烈的特異免疫反應。郭幸娟[6]采用全混流反應器通過實時調控pH 值和反應時間兩個物理參數來保證反應體系始終是連續和恒定的，實現氧化鋁納米顆粒連續、可控的合成過程。最終獲得了具有高度均一性的棒狀氧化鋁納米顆粒。在酸性環境下生成的氧化鋁納米棒表現出良好的穩定性和蛋白質吸附能力。表明該棒狀的氧化鋁可引發更持久性的免疫反應。與商業化佐劑相比，采用全混流反應技術連續生成的全混流反應納米棒羥基含量較高，結晶度較低，產生較強佐劑效應。寇亞楠等[5]采用HI 和ELISA 方法證實以納米鋁膠為佐劑，制備的PPV 滅活疫苗較其他佐劑疫苗組能顯著增強豬只的機體免疫效果，并刺激機體較早產生抗體，且免疫保護效果較好。

3 選用合適的培養基

滅活疫苗生產過程中，不同培養基組成對其發酵的活菌數及疫苗的免疫力有一定的影響。孫承文等[7]采用單因素試驗、響應面試驗法對維氏氣單胞菌發酵培養基優化組合，并與基礎培養基的發酵活菌數、制備的滅活疫苗免疫效力進行比較，經過驗證試驗，在優化發酵培養基（磷酸二氫鉀2.0 g/L，胰蛋白胨10.8 g/L，牛肉膏3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，NaCl 5.0 g/L）條件下，維氏氣單胞菌活菌數比基礎培養基增幅43.13%；制備的滅活疫苗相對保護率為77.78%，比基礎培養基提高了14.81%。通過對維氏氣單胞菌發酵培養基的優化，可以獲得低成本、優質高效的發酵菌液。筆者所在單位吉哈利等[8]利用羊鏈干粉培養基（杭州微生物試劑有限公司）與緩沖肉湯培養基，兩種不同的培養基培養羊敗血性鏈球菌株C55001、C55002，結果羊鏈干粉培養基培養的菌株活菌量達20×108CFU/mL，顯著高于單位常用的緩沖肉湯培養基活菌量；通過實驗發現該疫苗具有良好的免疫安全性與免疫原性，產生極好的免疫效果。

4 研制多聯滅活疫苗

隨著養殖業的規模擴大及舍飼養殖模式的普及，牲畜疾病經常混合感染，耐藥菌株增多，難以進行針對性用藥。因此，研制多聯滅活疫苗很有必要。

呂云揚[9]用奶山羊肺臟病料中分離出的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、大腸桿菌。用多殺性巴氏桿菌中的強毒株PM01、溶血性曼氏桿菌中的強毒株MH01、大腸桿菌強毒株EC01；用5%血清的BHI 肉湯培養的PM01、MH01 和LB 瓊脂肉湯培養的EC01，經滅活、濃縮純化，制備了兩種佐劑的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、大腸桿菌三聯滅活疫苗。經過評估，疫苗免疫效果良好，可以有效預防呼吸系統疾病，有推廣應用價值。呂茂杰[10]用PCV2 桿狀病毒載體表達的副豬嗜血桿菌4 型和5 型抗原、豬肺炎支原體抗原和Cap 蛋白抗原制備工藝優化，并確定三聯滅活疫苗中的抗原最小使用量，確定制苗標準（副豬嗜血桿菌5 型抗原2.0×109CFU/頭份、副豬嗜血桿菌4 型抗原4.0×109CFU/頭份、豬肺炎支原體抗原100 μg/頭份和Cap 蛋白50 μg/頭份）。該疫苗在安全性檢驗中未見異常。攻毒保護試驗中，免疫豬均獲得80%以上的保護率，血清抗體監測中抗體全部轉陽。免疫保護覆蓋范圍廣，可一針同時防控三種主要疫病。劉月月等[11]通過反向遺傳技術致弱而得到雞新城疫疫苗株N7a、H9 亞型保護譜廣的毒株SZ、雞傳染性支氣管炎病毒經典疫苗株M41，制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯滅活疫苗進行了安全性和有效性研究表明，疫苗安全性良好，能產生較好的免疫效力，能有效預防雞只感染，能減少單苗多次免疫造成的應激反應，降低免疫成本，創造更多的經濟價值（HPS5 型抗原2.0×109CFU/頭份，Mhp 抗原100 μg/頭份和HPS4 型抗原4.0×109CFU/頭份）。

5 總結與展望

近年來，隨著疫苗研究的不斷深入和知識經驗的積累，進一步開展相應的免疫學機理和機制研究，在獸用滅活疫苗生產過程中，滅活原液增加離心處理環節、凍干疫苗選擇合適的上樣量和洗脫流速等優化工藝流程，選用引發更持久性免疫反應的佐劑和增加發酵的活菌數及增強疫苗的免疫力的培養基，研制多聯滅活疫苗等方法獲得低成本、優質高效的獸用滅活疫苗。隨著養殖業的規模擴大及舍飼養殖模式的普及，能很大程度上減少單苗多次免疫造成的應激反應，降低免疫成本，創造更多的經濟效益。