鹽酸表柔比星有關物質系統適用性溶液制備方法探討

宋麗,張家寧,車慧,何麗娟（北京協和藥廠有限公司,北京 102600）

鹽酸表柔比星屬于廣譜抗腫瘤抗生素，由意大利Farmitalia Carlo Erba公司開發，1984年12月首次在意大利上市，1998年在中國上市，在美國、日本、英國等多國均獲批上市。鹽酸表柔比星及其制劑注射用鹽酸表柔比星收載于《中國藥典》2020年版。中國藥典標準有關物質項下需制備多柔比星酮、鹽酸多柔比星與鹽酸表柔比星的混合溶液作為系統適用性溶液。在實際工作中，我們發現該系統適用性溶液中多柔比星酮在溶液中不能完全溶解，有微量沉淀，采用超聲或渦旋輔助方法均不能改善多柔比星酮的溶解。本研究針對多柔比星酮溶解特性，建立了多柔比星酮溶液的制備方法，并進行比較和優化，提出藥典有關物質檢測方法可能的完善方案。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000高效液相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀，Chromeleon 7網絡版色譜工作站，ZORBAX TMS-C1柱（4.6×250mm，5μm）；Thermo Genpure Pro超純水機。

1.2 試藥 多柔比星酮對照品[1]（批號130676-201801，中國食品藥品檢定研究院）、多柔比星酮對照品（批號1844-074A5，TLC Pharmaceutical Standards）、鹽酸表柔比星對照品（批號130560-202104，中國食品藥品檢定研究院）、鹽酸多柔比星（批號130509-202104，中國食品藥品檢定研究院）、乙腈（色譜純，Fisher）、甲醇（色譜純，Fisher）、十二硫基硫酸鈉（色譜純，Sigma-Aldrich）、磷酸（色譜純，阿拉丁）、二甲基亞砜（DMSO，色譜級，阿拉丁）。

2 方法與結果

2.1 《中國藥典》2020年版制備方法 ①流動相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸鈉的混合溶液為流動相。②系統適用性溶液（藥典方法）：取多柔比星酮3mg、鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中分別約含多柔比星酮30μg、鹽酸多柔比星30μg與鹽酸表柔比星100μg的混合溶液。

2.2 本研究方法[2]①流動相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸鈉的混合溶液為流動相。②系統適用性溶液（本研究方法）：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻。取鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述兩種溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。③DMSO溶液：精密量取DMSO 1ml，置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定 精密量取流動相、DMSO溶液、系統適用性溶液（藥典方法）、系統適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄兩份系統適用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數、與相鄰峰的分離度。見表1，圖1-4。

表1 測定數據表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間基本一致，理論板數均大于2000。表明使用DMSO制備的系統適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質項的測定要求，對測定無干擾。

2.4 耐用性試驗 精密量取流動相、DMSO溶液、系統適用性溶液（藥典方法）、系統適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入另一臺高效液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄兩份系統適用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數、與相鄰峰的分離度。見表2。

表2 耐用性試驗數據表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間基本一致，理論板數均大于2000。表明使用DMSO制備的系統適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質項的測定要求，對測定無干擾。

2.5 重復性試驗 精密量取系統適用性溶液（藥典方法）、系統適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄各份溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數、與相鄰峰的分離度。重復性取系統適用性溶液（藥典方法）、系統適用性溶液（本研究方法）連續進樣5次。見表3。

表3 精密度試驗數據表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間相近，理論板數均大于2000。系統適用性溶液（本研究方法）的5張色譜圖中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留時間平均值分別為3.111min、8.301min、9.814min，RSD分別為0、0.03%、0.02%。系統適用性溶液（藥典方法）的5張色譜圖中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留時間平均值分別為3.113min、8.310min、9.820min，RSD分別為0.09%、0.03%、0.03%。兩個方法各峰保留時間相對平均偏差為0.03%、0.05%、0.03%，表明使用DMSO制備的系統適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質項的測定要求，對測定無干擾，精密度良好。

3 討論

3.1 本研究建立方法對不同來源多柔比星酮溶解情況的考察 目前國內的多柔比星酮對照品主要有兩個來源，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）和TLC Pharmaceutical Standards（以下簡稱TLC）。其中，中檢院來源的多柔比星酮為深棕色固體，未標示純度，僅供鹽酸表柔比星系統適用性試驗用。TLC來源的為紅褐色固體，純度在90%以上，可用于定量測定。采用本研究方法對兩個來源的多柔比星酮進行溶液制備，結果在日光燈下目視觀察，兩份溶液均為橙黃色澄清液體；在光照度lx1000下目視觀察，溶液均澄清。表明本研究建立方法適用于不同來源的多柔比星酮。

圖1 流動相色譜圖

圖2 DMSO溶液色譜圖

圖4 系統適用性溶液（本研究方法）色譜圖

為了對比多柔比星酮溶解情況，我們使用《中國藥典》[3]2020年版的方法對兩個來源的多柔比星酮進行考察。流動相加入后，多柔比星酮沒有溶解。使用超聲處理35min后，在日光燈下目視觀察，TLC來源的樣品未觀察到明顯沉淀，中檢院來源的樣品仍能觀察到少量的沉淀，靜置后，TLC來源的樣品溶液底部可觀察到有少量的沉淀，中檢院來源的樣品溶液觀察到沉淀增加；繼續使用渦旋處理3min，在日光燈下目視觀察，兩個來源的樣品溶液均有懸浮顆粒，中檢院來源的懸浮顆粒相對明顯。在實驗中我們對兩個來源的樣品溶液過濾前后分別進樣分析，同一來源的樣品溶液過濾前后峰面積沒有明顯變化，TLC來源的多柔比星酮峰面積較中檢院來源的峰面積大。兩個來源的多柔比星酮溶解性能的不同應與其純度相關。

3.2 各國藥典中多柔比星酮定位方法的比較 《歐洲藥典》、《美國藥典》、《日本藥局方》和《中國藥典》2020年版均收載了鹽酸表柔比星的質量標準。《中國藥典》2020年版還收載注射用鹽酸表柔比星的質量標準[4-5]。在有關物質項下，4部藥典在檢驗方法和雜質控制標準上有所不同。《日本藥局方》采用內標法控制雜質總量，沒有對多柔比星酮的控制要求。《美國藥典》和《歐洲藥典》均對總雜質、其他單個雜質和多柔比星酮、多柔比星等7個雜質進行控制，其中多柔比星酮是通過對鹽酸多柔比星進行酸破壞的方法獲得雜質峰鑒別溶液，然后通過相對保留時間定位多柔比星酮。《中國藥典》2020年版通過制備多柔比星酮、鹽酸多柔比星與鹽酸表柔比星的混合溶液作為系統適用性溶液進行峰定位，采用自身對照法對多柔比星酮、多柔比星、其他單個雜質和總雜質進行控制。

我們按照《美國藥典》和《歐洲藥典》的多柔比星酮定位溶液制備方法開展了相關試驗。結果表明，制備方法操作難度不大，加入酸破壞后需要放置30min，再加入一定濃度的堿進行中和。使用HPLC進樣分析，除多柔比星酮外，還檢出未被破壞的多柔比星及其他被破壞的雜質，影響多柔比星酮的辨識；且相比于本研究建立的方法，操作步驟較多，不便于日常檢驗。

3.3 溶劑的選擇 鹽酸表柔比星有關物質項下流動相為水、乙腈和甲醇的混合溶液，但在前述的溶解性能考察中發現多柔比星酮無法完全溶解。單獨使用水、乙腈和甲醇分別溶解多柔比星酮，均無法有效改善其溶解情況。因此需要使用其他溶解性能更好的溶劑。

查閱中國知網等數據庫，未查詢到相關文獻中對多柔比星酮溶解性的描述。TLC來源的多柔比星酮對照品的說明書中提到，使用DMSO作為溶劑進行溶液制備，色譜峰理論板數、拖尾因子均良好。因此選擇DMSO作為溶劑開展研究工作。經測試確定，采用本研究建立的DMSO溶解方法不影響有關物質檢測。

3.4 制備方法的選擇 在制備過程中，我們在考察本研究方法配備溶液外，同步考察使用DMSO制備溶液的其他方法。制備方法為：取多柔比星酮3mg，置100ml量瓶中，加DMSO 10ml溶解，再用流動相稀釋至刻度。研究發現該方法制備的溶液在光照度lx1000下目視觀察到極微量的懸浮微粒，澄清度較本研究建立的方法稍差，最終沒有采納該方法。

3.5 小結 本試驗通過對《中國藥典》2020年版中鹽酸表柔比星的有關物質項下系統適用性溶液中多柔比星酮的溶解情況的研究，確定了合理的系統適用性溶液的制備方法，為鹽酸表柔比星有關物質測定方法提供了優化方案。

建議《中國藥典》2020年版中鹽酸表柔比星有關物質項下系統適用性溶液修訂為：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻。取鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述兩種溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。